Presynapse Formation Assay Using Presynapse Organizer Beads and "Neuron Ball" Culture
概要
La formation de presynapse est un processus dynamique comprenant l’accumulation de protéines synaptiques dans l’ordre approprié. Dans cette méthode, la formation de presynapse est déclenchée par des perles conjuguées avec une protéine d’organisateur de presynapse sur des feuilles axonales de la culture de « boule de neurone », de sorte que l’accumulation des protéines synaptiques soit facile à analyser pendant la formation de presynapse.
Abstract
Pendant le développement neuronal, la formation de synapse est une étape importante pour établir des circuits neuraux. Pour former des synapses, les protéines synaptiques doivent être fournies dans l’ordre approprié par transport à partir de corps cellulaires et/ou par traduction locale dans des synapses immatures. Cependant, il n’est pas entièrement compris comment les protéines synaptiques s’accumulent dans les synapses dans l’ordre approprié. Ici, nous présentons une nouvelle méthode pour analyser la formation presynaptique en utilisant la combinaison de la culture de boule de neurone avec des perles pour induire la formation de presynapse. Les boules de neurones qui sont des agrégats cellulaires neuronaux fournissent des feuilles axonales loin des corps cellulaires et des dendrites, de sorte que les signaux fluorescents faibles des presynapses peuvent être détectés en évitant les signaux accablants des corps cellulaires. Comme perles pour déclencher la formation de presynapse, nous utilisons des perles conjuguées avec le neuromembrane de transmembrane de répétition leucine-riche 2 (LRRTM2), un organisateur presynaptic excitateur. En utilisant cette méthode, nous avons démontré que le transporteur vésiculaire de glutamate 1 (vGlut1), une protéine synaptique de vésicule, s’est accumulé dans les presynapses plus rapidement que Munc18-1, une protéine active de zone. Munc18-1 a accumulé la traduction-dépendant dans la presynapse même après avoir enlevé des corps cellulaires. Cette constatation indique l’accumulation de Munc18-1 par traduction locale dans les axones, et non par le transport des corps cellulaires. En conclusion, cette méthode convient pour analyser l’accumulation de protéines synaptiques dans les presynapses et la source de protéines synaptiques. Comme la culture neuronale est simple et qu’il n’est pas nécessaire d’utiliser un appareil spécial, cette méthode pourrait s’appliquer à d’autres plates-formes expérimentales.
Introduction
La formation de Synapse est l’une des étapes critiques pendant le développement des circuits neuronaux1,2,3. La formation de synapses qui sont des compartiments spécialisés composés de pré- et de post-synapses est un processus complexe et en plusieurs étapes impliquant la reconnaissance appropriée des axones et des dendrites, la formation de la zone active et la densité postsynaptique, et l’alignement approprié de canaux ioniques et récepteurs neurotransmetteurs1,2. Dans chaque processus, de nombreux types de protéines synaptiques s’accumulent dans ces compartiments spécialisés au bon moment en transportant des protéines synaptiques à partir de corps cellulaires et/ou par traduction locale dans les compartiments. Ces protéines synaptiques sont considérées comme organisées de manière organisée pour former des synapses fonctionnelles. Dysfonctionnement de certaines protéines synaptiques impliquant la formation de synapse entraîne des maladies neurologiques4,5. Cependant, il reste difficile de savoir comment les protéines synaptiques s’accumulent dans le bon timing.
Pour étudier comment les protéines synaptiques s’accumulent de manière organisée, il est nécessaire d’examiner l’accumulation de protéines synaptiques dans l’ordre chronologique. Quelques rapports ont démontré l’imagerie en direct pour observer la formation de synapse dans la culture dissociée des neurones6,7. Cependant, il est long de trouver des neurones qui commencent juste la formation de synapse sous microscopie. Pour observer efficacement l’accumulation de protéines synaptiques, la formation de synapse doit commencer au moment où les chercheurs veulent induire la formation. Le deuxième défi consiste à distinguer l’accumulation de protéines synaptiques due au transport des corps cellulaires ou à la traduction locale dans les synapses. À cette fin, le niveau de traduction est nécessaire pour être mesuré dans la condition qui ne permet pas le transport des protéines synaptiques à partir des corps cellulaires.
Nous avons développé le nouveau presynapse formation d’essayer utilisant la combinaison de la culture de boule de neurone avec des perles pour induire la formation de presynapse8. La culture de boule de neurone est développée pour examiner le phénotype axonal, dû à la formation des feuilles axonales entourant des corps cellulaires9,10. Nous avons utilisé des perles magnétiques conjuguées avec le neuromembrane de transmembrane répéter laleucine-riche 2 (LRRTM2) qui est un organisateur presynaptic pour induire des presynapses excitatrices (figure 1A)11,12,13. En utilisant les perles LRRTM2, la formation de présynapse commence au moment où les perles sont appliquées. Cela signifie que la formation de présynapse commence dans des milliers d’axones d’une boule de neurone en même temps, ce qui permet d’examiner le cours précis du temps de l’accumulation de protéines synaptiques efficacement. En outre, la culture de boule de neurone est facile de bloquer les protéines synaptiques de transport de soma en enlevant des corps cellulaires (figure 1B)8. Nous avons déjà confirmé que les axones sans corps cellulaires peuvent survivre et sont en bonne santé au moins 4 h après l’ablation des corps cellulaires. Ainsi, ce protocole est approprié pour étudier d’où les protéines synaptiques sont dérivées (corps cellulaire ou axone), et comment les protéines synaptiques s’accumulent de manière organisée.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons développé la nouvelle méthode pour examiner la formation de presynapse stimulée avec des perles de LRRTM2 utilisant la culture de boule de neurone. Actuellement, la plupart des tests de formation de presynapse comprennent des perles enduites de poly-D-lysine (PDL) et une culture dissociée/chambre microfluidique20,21,22. L’un des avantages de cette méthode est l’alds LRRTM2. Tandis que LRRTM2 interagit avec la ne…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail est en partie soutenu par JSPS Grant-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI) (C) (No. 22500336, 25430068, 16K07061) (Y. Sasaki). Nous remercions le Dr Terukazu Nogi et Mme Makiko Neyazaki (Yokohama City University) d’avoir gentiment fourni des protéines LRRTM2 biotinylated. Nous remercions également Honami Uechi et Rie Ishii pour leur assistance technique.
Materials
| Antibody diluent | DAKO | S2022 | |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-585-151 | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-545-152 | |
| mouse anti-Munc18-1 | BD Biosciences | 610336 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| Bovine Serum Alubumin (BSA) | Nacalai Tesque | 01863-48 | |
| Cell-Culture Treated Multidishes (4 well dish) | Nunc | 176740 | |
| Complete EDTA-free | Roche | 11873580001 | |
| cooled CCD camera | Andor Technology | iXON3 | |
| Coverslip | Matsunami | C015001 | Size: 15 mm, Thickness: 0.13-0.17 mm |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside (AraC) | Sigma-Aldrich | C1768 | |
| 4',6-Diamidino-2-phenylindole Dihydrochloride (DAPI) | Nacalai Tesque | 11034-56 | |
| Deoxyribonuclease 1 (DNase I) | Wako pure chemicals | 047-26771 | |
| Expi293 Expression System | Thermo Fisher Scientific | A14635 | |
| Horse serum | Sigma-Aldrich | H1270 | |
| image acquisition software | Nikon | NIS-element AR | |
| Image analysis software | NIH | Image J | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Inverted fluorecent microscope | Nikon | Eclipse Ti-E | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Neurobasal media | Thermo Fisher Scientific | #21103-049 | |
| Normal Goat Serum (NGS) | Thermo Fisher Scientific | #143-06561 | |
| N-propyl gallate | Nacalai Tesque | 29303-92 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Nacalai Tesque | 26126-25 | |
Paraplast Plus |
Sigma-Aldrich | P3558 | |
| Poly-L-lysine Hydrobromide (MW > 300,000) | Nacalai Tesque | 28359-54 | |
| poly (vinyl alcohol) | Sigma | P8136 | |
| Prepacked Disposable PD-10 Columns | GE healthcare | 17085101 | |
| rabbit anti-vesicular glutamate transporter 1 | Synaptic Systems | 135-302 | |
| SCAT 20X-N (neutral non-phosphorous detergent) | Nacalai Tesque | 41506-04 | |
| Streptavidin-coated magnetic particles | Spherotech Inc | SVM-40-10 | diameter: 4-5 µm |
| TritonX-100 | Nacalai Tesque | 35501-15 | |
| Trypsin | Nacalai Tesque | 18172-94 |
参考文献
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