צומת וצלחת notochordal בארעיותם איתות המארגנים בפיתוח עוברי העכבר זה ניתן לאבחן באמצעות מספר טכניקות. כאן נתאר בפירוט כיצד לבצע את שתי הטכניקות כדי ללמוד את המבנה ואת מורפוגנזה: 1) סריקה מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM); ו- 2) כל הר immunofluorescence (WMIF).
העובר שלאחר ההשתלה העכבר עובר שינויי הצורה הגדולות לאחר אתחול של gastrulation, מורפוגנזה. סימן היכר של מורפוגנזה היא היווצרות של המארגנים ארעי, הצומת ואת צלחת notochordal, התאים עברו הרצף השלילי פרימיטיבי. היווצרות נאותה של מרכזים אלה איתות חיוני להתפתחות של התוכנית הגוף, טכניקות כדי להמחיש להם עניין גבוהה ביולוגים התפתחותיים העכבר. צומת וצלחת notochordal לשכב על המשטח הגחון של עוברי gastrulating העכבר מתחלקים היום (ה) 7.5 של פיתוח. הצומת הוא מבנה דמוי ספל אשר התאים בעלי של יחיד ודק ריסי בכל. נאות לוקליזציה subcellular והסיבוב של cilia בבור הצומת קובע אסימטריה משמאל לימין. התאים notochordal צלחת גם מחזיקים cilia יחיד אמנם קצר יותר מאשר אלה של התאים צומת. הצלחת notochordal יוצרת את מיתר הגב אשר משמש מארגן איתות חשוב עבור somitogenesis והמתבנת עצבית. כי התאים של הצומת וצלחת notochordal transiently נמצאים על פני השטח ושולט cilia, הם להיות visualized באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים סריקה (SEM). בין טכניקות אחרות נהגו להמחיש את המבנים הללו ברמה התאית היא כל הר immunofluorescence (WMIF) באמצעות הנוגדנים נגד החלבונים מאוד הבאות לידי ביטוי צומת ואת צלחת notochordal. בדו ח זה, אנו מתארים שלנו פרוטוקולים ממוטבת כדי לבצע SEM ו- WMIF של הצומת וצלחת notochordal העוברים פיתוח העכבר כדי לסייע הערכה של רקמות הצורה והארגון הסלולר פראי-סוג, העוברים מוטציה gastrulation.
Gastrulation התנועות morphogenetic הנלווים הם חיוניים לעיצוב של העובר העכבר1. השינויים צורה התאית ובארגון במהלך מורפוגנזה להכתיב מידע לפי מיקום כדי לווסת את גורל ולאפשר גם המסלולים איתות שהתפתח לבצע בדיוק את הפונקציות שלהם כדי לגוון את שכבות הנבט שהוקם1. היווצרות של ארגון מבנים ארעיים איתות מרכזי כגון צומת ו מיתר הגב חיוני עבור הביצוע של תוכנית התפתחותית2. ביולוגים התפתחותיים השתמשו במגוון טכניקות כדי ללמוד את מורפוגנזה של מבנים אלה, הבולטים ביותר של אשר הוא השימוש של כתבים הסלולר, חיים שמחוץ הדמיה לעקוב אחר הדינמיקה בהתנהגות הסלולר, subcellular2 3, ,4. בדו ח זה, אנו מתמקדים המתארת את הפרטים של פרוטוקולים ממוטבת שלנו עבור שתי הטכניקות הללו: סריקה מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM) ואת כל הר immunofluorescence (WMIF), אשר היו ואינם אינסטרומנטלי עדיין לומד את מורפוגנזה של הצומת הצלחת notochordal, מבשר של מיתר הגב.
הצומת עובריים בעכבר זה בצורת דמעה כוס תאים הנמצא על פני השטח הגחון של העובר העכבר מסביב המוקדמות כדי שהאח קיפול הראש במהלך gastrulation, מורפוגנזה (יום עובריים, E7.5-E8)2,5, 6,7. הצלחת notochordal מורפולוגית נובע anteriorly צומת3. כל תא בצומת וצלחת notochordal מאופיינת ריסי אחת המגיחה החיצוני, שהוא ארוך בתאים צומת אך אורכו משתנה עם שלב התפתחותי2. הרוטציה של cilia בבור צומת הוכח להיות חשוב עבור מערכת אזעקה הקובע משמאל אסימטריה4. הצלחת notochordal הוא מבשר של מיתר הגב, המרכז איתות כי חשוב המתבנת של somites הסמוך ו- שפופרת פגמים בתעלה שמעליה3.
בשל התכונות של מיקום (פני השטח), צורה (כוס), אחזקת מבנים הסלולר החיצוני ברורים (cilia), SEM באופן מסורתי שימש כדי להמחיש את צומת ואת צלחת notochordal וללמוד שלהם צורה ומבנה2, 7. SEM משמש גם ללמוד את השינויים במבנה של הצומת עצמו או של cilia בתאי שלה במוטציות המשפיעות על gastrulation, מורפוגנזה, וכן cilia היווצרות8,9,10. SEM היא טכניקה אשר מנצל קרן אלקטרונים לחקור את ultrastructure טופולוגי של המשטח החיצוני של חומרים כגון דגימות ביולוגיות11ממוקד. המדגם היא בדרך כלל קבוע, מיובשים, ואז לרעוד. להוציא-מצופה מתכות להסתכלות במיקרוסקופ אלקטרונים סריקה כפי שנתאר בשלב 1.
WMIF היא טכניקה מכתימים להמחיש מוצרים ג’ין, כגון חלבונים, שלוש-מימד (3D). WMIF של רקמות, איברים או אורגניזם שלם אפילו מספק מידע מרחבי על ההתפלגות של האות ושל צורת המבנה שנוצר ב- 3D. הטכניקה מבוססת על תיקון המדגם ואז מכתימה את זה עם conjugates פלורסנט. עכבר עוברי ~ E7.5 הם קטנים ולא שקוף ולכן אידיאלי עבור WMIF פרוטוקולים להמחיש את צומת ואת צלחת notochordal. לדוגמה, הפקטור שעתוק Barchyury (T) מתבטאת הגרעינים של הצומת וצלחת notochordal, ובמידה פחותה ב רצף פרימיטיבי, סביב E7.5-E8 ושל התפתחות נוגדנים עבודה טובה נגד טי מאת WMIF הן מבחינה מסחרית זמין ולהפוך את ההליך מכתימים אפשרי. התאים של הצומת וצלחת notochordal מאופיינים גם מכווץ משטחים הפסגה, אשר פנים בחוץ, ולכן יכול להיות מוכתם Phalloidin מצומדת פלורסצנטיות לסימון F-אקטין-הפסגה constrictions. באמצעות נוגדנים אלה כדוגמאות, השילוב של T ו- F-אקטין צביעת על-ידי WMIF מספק ייצוג של הצומת וצלחת notochordal תלת-ממד gastrulating עוברי העכבר כמו נדגים שלב 2 8. עם זאת, סמנים של cilia, כגון ARL13B או acetylated טובולין, כמו גם סמנים אחרים של הצומת וצלחת notochordal, כגון FOXA2, יכול לשמש גם כדי לבצע WMIF על פיתוח העכבר עוברי3,4.
אנחנו הראו כי striatin-אינטראקציה חלבון 1 (STRIP1) חיונית עבור gastrulation רגיל ומורפוגנזה העובר העכבר8. STRIP1 הוא רכיב ליבה של phosphatases striatin-אינטראקציה, קומפלקסים kinases (STRIPAK), אשר אנחנו ואחרים לסבך8,12הארגון שלד התא אקטין. פגם העיקריים העוברים מוטציה Strip1 הוא היווצרות והמזודרם צירית (צומת וצלחת notochordal) והסיומת של הציר גישה antero-אחוריים הגוף. השתמשנו SEM ו- WMIF כדי לנתח את צומת ואת צלחת notochordal פראי-סוג (WT), העוברים מוטציה Strip1 כפי שנראה נציג תוצאות , דמויות המתאימים.
בעבודה זאת, נדגים כיצד לבצע SEM, WMIF כדי להמחיש את הצומת עובריים בעכבר וצלחת notochordal. גודל קטן של עוברי העכבר gastrulating ~ E7.5 ואת נוכחותם של מבנים אלה על פני להפוך אותם אידיאלי ללמוד באמצעות טכניקות תיאר2,7,8. הזמינות של נוגדנים טובים, כגון סמני T ו- cilia, נותן מצוינים נתוני תלת-ממד באמצעות WMIF על מבנה, ארגון היווצרות אלה חיוניים המארגנים עובריים8.
בגלל התפתחות עובריים בעכבר מתקדם בקצב מהיר מאוד ולא צומת ואת צלחת notochordal נמצאים רק transiently על פני השטח של העובר, תזמון חיוני להצלחה של ניסויים אלה,2,3. לדוגמה, 2-4 somite עוברי טובים לניתוח SEM של בור צומת בוגרת עם cilia ארוך. ב הרבה מוקדמות או מאוחרות יותר עוברי (לדוגמה, 12 שעות לפני או אחרי), הצומת לא יהיה נוכח על פני השטח. WMIF קצת יותר גמיש בהקשר זה אבל המבנים עצמם הם גם חולף במהלך הפיתוח, העיתוי תלוי במקרה זה על האינטרסים החוקרים.
הטוהר של ריאגנטים היא חיונית להצלחת שיטות אלה, ובמיוחד בודק את ultrastructure על ידי זיהומים זעירה ב- SEM. זה מקל העוברים בדרך כלל לגרום חפצים ענק.
בדקנו את שתי שיטות שונות של העובר קיבוע עבור SEM אחד באמצעות לשבועיים של חצי Karnovsky (2.5% גלוטראלדהיד, מאגר cacodylate paraformaldehyde ו- 0.1 M 2%) וגלוטראלדהיד פשוטים יותר של 2.5% ב- 1 x PBS. אנו מעדיפים להשתמש גלוטראלדהיד מקבע PBS כפי שמתואר בשלב 1, עם זאת, אנחנו ואחרים יש להשתמש גם לשבועיים של Karnovsky חצי בהצלחה ב- SEM.
לנו יש גם בהשוואה שתי שיטות של מייבש את העוברים SEM ולא מצאו שום הבדל באיכות הדגימה באמצעות נקודה קריטית מייבש או HMDS כפי שמתואר בשלב 1 ודיווח במקום אחר14.
שלב 2, בדקנו הטבעה העוברים לאחר כביסה סופי בשלבים 1% agarose ההיתוך נמוכה רכוב על צלחת זכוכית-התחתון 35 מ מ, ואז ציפוי עם ~ 10 µL של הרכבה בינונית. שיטה זו ההטבעה עובד ושומר את המבנה התלת-ממד המקורי של העובר מבנים הקשורים; עם זאת, מיקרוסקופ multiphoton נדרשת תמונה הדגימה כי מיקרוסקופ קונפוקלי הרגיל לא יכול להגיע עמוק לתוך העוברים תקין (~ 1 מ”מ).
אנו מאמינים כי שיטות אלה שני נותן משלימים מידע על המבנה של הצומת, את הצלחת notochordal במהלך התפתחות נורמלי מוטציות שמראים פגמים על היווצרות מבנים אלה.
The authors have nothing to disclose.
H.B. נתמך על ידי אתחול מימון מן הפקולטה לרפואה SFB829 באוניברסיטת קולון. C.X. נתמך על-ידי DFG להעניק תואר ראשון 5810/1-1. ברצוננו להודות במתקני הדמיה CECAD מרכז מחקר, מרכז הסרטן סלואן קטרינג הנצחה (ניו יורק, ארה ב). אנו מודים חואקין גרגו-Bessa (ספרדית המרכז הלאומי למחקר קרדיו, מדריד, ספרד) על שלו תובנה על הרכבה העוברים על WMIF.
1,1,1,3,3,3 Hexamethyldisilazane (HMDS) | Carl Roth | 3840 | |
Anti-T antibody | R&D Systems | AF2058 | |
Critical Point Dryer | Blazers Union | CPD 020 | |
DAPI | AppliChem | A4099,0005 | |
Glutardialdehyde solution 25% | Merck | 1042390250 | |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
Tween 20 | AppliChem | A4974,0500 | |
SEM coating unit PS3 | Agar Aids for Electron Microscopy | PS3 | |
SEM microscope Quantum FEG 250 | ThermoFisher Scientific (FEI) | Quantum FEG 250 |