Die Knoten und notochordal Platte sind vergänglich Signalisierung Organisatoren bei der Entwicklung von Mäuseembryonen, die mit mehreren Techniken visualisiert werden können. Hier beschreiben wir im Detail wie Sie zwei Techniken ihre Struktur und Morphogenese durchführen: 1) Rasterelektronenmikroskopie (SEM); und 2) ganze Berg Immunfluoreszenz (WMIF).
Nach der Implantation Mausembryos erfährt große Formänderungen nach der Einleitung der Gastrulation und Morphogenese. Ein Markenzeichen der Morphogenese ist die Bildung der Transienten-Organisatoren, die Knoten und notochordal Platte aus Zellen, die das primitive Streak durchlaufen haben. Die richtige Bildung dieser Signalisierung Zentren ist essentiell für die Entwicklung des Körpers Plans und Techniken, um sie zu visualisieren sind von großem Interesse für die Maus Entwicklungs Biologen. Die Knoten und notochordal Platte liegen auf der ventralen Oberfläche der gastrulating Mausembryonen um embryonale Tag (E) 7.5 Entwicklung. Der Knoten ist eine schalenförmige Struktur, deren Zellen einen einzigen schlanken Zilie besitzen. Die richtige subzelluläre Lokalisation und die Drehung der Zilien in der Knoten-Grube bestimmt, links-rechts-Asymmetrie. Die notochordal Platte Zellen besitzen auch einzelne Zilien, wenn auch kürzer als die der Knoten Zellen. Die notochordal Platte bildet die Chorda fungiert als wichtige Signalisierung Veranstalter für Somitogenesis und neuronale Musterbildung. Da die Zellen des Knotens und notochordal Platte befinden sich vorübergehend auf der Oberfläche und Cilien besitzen, können sie mit Rasterelektronenmikroskopie (SEM) visualisiert werden. Unter anderen Techniken zur Visualisierung verwendet diese Strukturen auf zellulärer Ebene ist ganze Berg Immunfluoreszenz (WMIF) mit Hilfe der Antikörper gegen die Proteine, die hoch in den Knoten und notochordal Platte zum Ausdruck kommen. In diesem Bericht beschreiben wir unsere optimierte Protokolle um SEM und WMIF des Knotens und notochordal Platte in Entwicklungsländern Mäuseembryonen, helfen bei der Beurteilung der Gewebe Form und zelluläre Organisation in Wildtyp und Gastrulation mutierten Embryonen durchzuführen.
Gastrulation und die begleitenden morphogenetischen Bewegungen sind entscheidend für die Gestaltung der Maus-Embryo-1. Die Veränderungen in der zellulären Form und Organisation während der Morphogenese diktieren Positionsinformationen zu regulieren Zelle Schicksal und erlauben auch die anschließenden Signalwege genau ihre Aufgaben der neu gegründeten Mikrobeschichten1zu diversifizieren. Die Bildung der Transienten Organisation Strukturen und Signalisierung Zentren wie die Knoten und die Chorda ist essentiell für die Ausführung von Entwicklungs Programm2. Entwicklungs Biologen haben eine Vielzahl von Techniken verwendet, um die Morphogenese dieser Strukturen, am bemerkenswertesten ist die Verwendung von zellulären Reporter und live- ex-Vivo imaging, die Dynamik zellulärer und subzellulärer Verhalten2 Folgen zu studieren ,3,4. In diesem Bericht konzentrieren wir uns auf die Details unserer optimierte Protokolle für zwei dieser Techniken zu beschreiben: Scannen von Rasterelektronenmikroskopie (SEM) und ganze Berg Immunfluoreszenz (WMIF), die waren und sind immer noch maßgeblich bei der Untersuchung der Morphogenese des Knotens und die notochordal Platte, die Vorläufer der Chorda.
Der embryonalen Maus-Knoten ist eine tropfenförmige Tasse von Zellen, die auf der ventralen Oberfläche des Mausembryos in den frühen bis späten Kopf Falte Phasen während der Gastrulation und Morphogenese (embryonale Tag, E7.5-E8) befindet2,5, 6,7. Die notochordal Platte entspringt morphologisch anterior Knoten3. Jede Zelle in den Knoten und notochordal Platte zeichnet sich durch einen einzigen Zilie, die nach außen ragt, die länger in Knoten Zellen aber deren Länge variiert mit der Entwicklungsstufe2. Die Rotation der Flimmerhärchen in der Knoten-Grube hat sich gezeigt, wichtig für die Signalisierung, die links-rechts-Asymmetrie4bestimmt. Die notochordal Platte ist der Vorläufer der Chorda, die Signalisierung Zentrum, das für die Strukturierung von der angrenzenden Somiten und die darüberliegenden Neuralrohr3wichtig.
Wegen der Eigenschaften der Lage (Oberfläche), Form (Pokal) und besitzen unterschiedliche äußere Zellstrukturen (Zilien) wurde SEM traditionell verwendet, um Knoten und notochordal Platte zu visualisieren und studieren ihre Entstehung und Struktur2, 7. SEM wird auch verwendet, um die Veränderungen in der Struktur der Knoten selbst oder die Cilien auf seine Zellen in Mutationen, die Gastrulation, Morphogenese sowie Zilien Bildung8,9,10betreffen zu studieren. SEM ist eine Technik, die einen fokussierten Strahl von Elektronen, die topologische Ultrastruktur der äußeren Oberfläche der Materialien wie biologischer Präparate11Verhören nutzt. Die Probe ist in der Regel fest, getrocknet und dann Sputter-beschichtet mit Metallen für die Beobachtung unter dem Rasterelektronenmikroskop wie in Schritt 1 beschrieben.
WMIF ist eine Färbung Technik, Gen-Produkte, wie zum Beispiel Proteine, dreidimensionalen (3D) zu visualisieren. WMIF von Gewebe, Organen oder sogar ganze Organismen bietet räumliche Informationen über die Verteilung des Signals und die Form der daraus resultierenden Struktur in 3D. Die Technik basiert auf die Festsetzung der Probe, die sie dann mit fluoreszierenden Konjugate beflecken. Maus-Embryonen ~ E7.5 sind klein und transparent und daher ideal für WMIF Protokolle, Knoten und notochordal Platte zu visualisieren. Beispielsweise der Transkriptionsfaktor, die Barchyury (T) zum Ausdruck kommt, in den Kernen des Knotens und notochordal Platte und in geringerem Maße in der primitive Streak, um E7.5-E8 der Embryonalentwicklung und gut funktionierende Antikörper gegen T von WMIF sind im Handel zur Verfügung und ermöglichen das Färbeverfahren. Die Zellen des Knotens und notochordal Platte zeichnen sich auch durch verengte apikalen Oberflächen, die außen stehen und somit kann auch gebeizt mit Fluoreszenz-konjugiert Phalloidin, Mark F-Aktin an der apikalen Verengungen. Unter Verwendung dieser Reagenzien als Beispiele, bietet die Kombination aus T und F-Aktin Färbung von WMIF eine Darstellung des Knotens und notochordal Platte in 3D in gastrulating Mäuseembryonen, wie wir in Schritt2 8zeigen. Jedoch können Marker der Zilien, wie ARL13B oder Schimmelpilzschäden Tubulin sowie anderen Markern des Knotens und notochordal Platte, z. B. FOXA2, auch durchführen WMIF auf entwickelnden Maus Embryonen3,4verwendet werden.
Wir haben gezeigt, dass striatin-Interaktion Protein 1 (STRIP1) für normale Gastrulation und Morphogenese in der Maus Embryo8unerlässlich. STRIP1 ist eine Kernkomponente des striatin-Interaktion Phosphatasen und Kinasen-komplexe (STRIPAK), die wir und andere in den Aktin-Zytoskelett Organisation8,12in Verbindung gebracht haben. Ein schwerwiegenden Mangel in Strip1 mutierten Embryonen ist bei der Bildung der axialen Mesoderm (Knoten und notochordal Platte) und Erweiterung der Antero-posterioren Körperachse. Wir haben SEM und WMIF verwendet, um den Knoten und notochordal Platte im Wildtyp (WT) und Strip1 mutierten Embryonen zu analysieren, wie wir in die Vertreter Ergebnisse und Vergleichszahlen zeigen.
In dieser Arbeit zeigen wir wie Sie SEM und WMIF um die embryonalen Maus Knoten und notochordal Platte visualisieren durchführen. Die geringe Größe des gastrulating Mausembryonen ~ E7.5 und das Vorhandensein von diesen Strukturen auf der Oberfläche sind sie ideal zu studieren, mit den Techniken beschrieben2,7,8. Die Verfügbarkeit von guten Antikörper, wie T und Zilien Marker gibt ausgezeichnete 3D Informationen über die Struktur, Organisation und Bildung von diesen wesentlichen embryonalen Organisatoren8WMIF.
Weil Maus Embryonalentwicklung in einem sehr schnellen Tempo verläuft und die Knoten und notochordal Platte nur vorübergehend auf der Oberfläche des Embryos vorhanden sind, ist das Timing entscheidend für den Erfolg dieser Experimente2,3. Beispielsweise eignen sich 2-4 Somiten Embryonen für SEM-Analyse einer Reifen Knoten Grube mit langen Cilien. In viel früheren oder späteren Embryonen (z. B. 12 h vor oder nach) kann der Knoten nicht auf der Oberfläche vorliegen. WMIF ist in dieser Hinsicht ein wenig flexibler aber die Strukturen selbst sind auch vorübergehend während der Entwicklung und das Timing hängt in diesem Fall die Forscher Interessen.
Die Reinheit der Reagenzien ist auch entscheidend für den Erfolg dieser Techniken, vor allem in sondieren die Ultrastruktur von SEM Tiny Verunreinigungen, die in der Regel mit den Embryonen bleiben führen Sie riesige Artefakte.
Wir haben zwei verschiedene Methoden der Embryo Fixierung für SEM eines getestet mit halben Karnovsky Fixiermittel (2,5 % Glutaraldehyd, 2 % Paraformaldehyd und 0,1 M Cacodylate-Puffer) und ein einfacher 2,5 % Glutaraldehyd in 1 X PBS. Wir bevorzugen die Glutaraldehyd und PBS Fixiermittel wie in Schritt 1 beschrieben, jedoch wir und andere haben auch die halbe Karnovsky Fixiermittel erfolgreich eingesetzt für SEM
Wir haben auch zwei Methoden der Trocknung der Embryos für SEM verglichen und fanden keinen Unterschied in der Qualität der Probe entweder mithilfe einer kritischen Punkt Trockner oder HMD wie in Schritt 1 beschrieben und berichtet an anderer Stelle14.
Für Schritt2, wir testeten Einbettung der Embryonen nach der endgültigen Waschschritten in 1 % niedrig schmelzende Agarose auf eine 35 mm Glasboden Schüssel montiert und dann Richtfest es mit ~ 10 µL Eindeckmedium. Diese Einbettung Methode funktioniert und bewahrt die ursprüngliche 3D-Struktur des Embryos und zugehörigen Strukturen; multiphoton Mikroskop ist jedoch erforderlich, um die Probe Bild, da eine regelmäßige confocal Mikroskop nicht so tief in die intakten Embryonen erreichen kann (~ 1 mm).
Wir glauben, dass mit diesen beiden Techniken gibt ergänzende Informationen über die Struktur des Knotens und der notochordal Platte während der normalen Entwicklung und Mutanten die Mängel bei der Bildung dieser Strukturen zeigen.
The authors have nothing to disclose.
H.B wird unterstützt durch die Start-up Finanzierung von der medizinischen Fakultät und SFB829 von der Universität zu Köln. C.X wird von der DFG unterstützt BA 5810/1-1 zu gewähren. Wir möchte die Imaging-Einrichtungen am CECAD Forschungszentrum und Memorial Sloan Kettering Cancer Center (New York, USA). Wir danken für seine Einsicht bei der Montage der Embryos für WMIF Joaquín Grego-Bessa (Spanisch National Center for Cardiovascular Research, Madrid, Spanien).
1,1,1,3,3,3 Hexamethyldisilazane (HMDS) | Carl Roth | 3840 | |
Anti-T antibody | R&D Systems | AF2058 | |
Critical Point Dryer | Blazers Union | CPD 020 | |
DAPI | AppliChem | A4099,0005 | |
Glutardialdehyde solution 25% | Merck | 1042390250 | |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
Tween 20 | AppliChem | A4974,0500 | |
SEM coating unit PS3 | Agar Aids for Electron Microscopy | PS3 | |
SEM microscope Quantum FEG 250 | ThermoFisher Scientific (FEI) | Quantum FEG 250 |