노드 및 notochordal 플레이트는 일시적 이며, 여러 가지 기술을 사용 하 여 시각 될 수 있는 마우스 배아 개발 주최 신호 여기, 우리가 자세히 설명 두 그들의 구조 및 morphogenesis 연구 기법을 수행 하는 방법: 1) 스캐닝 전자 현미경 (SEM); 그리고 2) 전체 마운트 면역 형광 검사 (WMIF).
후 이식 마우스 배아 gastrulation 및 morphogenesis 개시 후 주요 모양 변화를 겪 습. Morphogenesis의 특징은 과도 주최, 노드 notochordal 접시, 원시 조 흔을 통해 통과 하는 셀의 형성. 적절 한 형성이 신호 센터의 몸 계획의 개발을 위해 필수적 이며 마우스 발달 생물학에 대 한 높은 관심은 그들을 시각화 하는 기법. 노드 및 notochordal 플레이트 gastrulating 마우스 배아 배아 하루 (E) 7.5 개발의의 복 부 표면에 거짓말. 노드는 그 셀 보유 한 단일 슬림 cilium 각 컵 모양의 구조. 적절 한 subcellular 지 방화 및 노드 구 덩이에 속눈썹의 회전 좌우 비대칭을 결정 합니다. Notochordal 플레이트 셀 또한 노드 셀 보다 짧은 이기는 하지만 단일 속눈썹을가지고. Notochordal 플레이트 notochord somitogenesis 및 신경 패턴에 대 한 중요 한 신호 주최자 역할을 형성 한다. 때문에 노드 및 notochordal 플레이트의 세포 표면에 뚜렷이 존재 하 고 속눈썹을가지고, 그들은 스캐닝 전자 현미경 (SEM)을 사용 하 여 구상 될 수 있다. 시각화 하는 데 사용 하는 다른 기술을 세포 수준에서 이러한 구조 전체 마운트 면역 형광 (WMIF)가 높은 노드 및 notochordal 격판덮개에 표시 된 단백질에 대 한 항 체를 사용 하 여입니다. 이 보고서에서 우리는 우리의 최적화 된 프로토콜의 조직 형태와 야생-타입에서 세포 조직 평가에 도움을 개발 마우스 배아 및 gastrulation 돌연변이 배아 SEM 및 WMIF 노드와 notochordal 플레이트의 수행을 설명 합니다.
Gastrulation와 동반 전체적 움직임은 마우스 배아1형성을 위해 결정적 이다. 세포 모양과 morphogenesis 조직에 변화 세포 운명을 통제 하 고 뒤이어 신호 경로 정확 하 게 새로 형성된 된 세균 레이어1을 다변화 하기 그들의 기능을 수행 하도록 허용 하는 위치 정보를 지정 합니다. 일시적인 구조를 구성 하 고 노드 및 notochord 같은 센터를 신호 형성 발달 프로그램2의 실행을 위해 필수적 이다. 발달 생물학의 이러한 구조, 세포 기자와 라이브 ex vivo 세포 및 subcellular 동작2의 역학에 따라 이미지의 사용은의 가장 주목할 만한 morphogenesis 공부 기술의 다양 한 사용 ,,34. 이 보고서에서 우리는 두 이러한 기술에 대 한 우리의 최적화 된 프로토콜의 세부 묘사에 초점: 스캐닝 전자 현미경 (SEM) 및 전체 마운트 면역 형광 검사 (WMIF)를 노드의 morphogenesis 공부에서 여전히 쓸모 있다 그리고 notochordal 격판덮개는 notochord의 선구자.
마우스 배아 노드는 눈물 모양의 컵 셀의 gastrulation 및 morphogenesis (배아 일, E7.5-E8) 중 후반 머리 배 단계를 초기 주위 마우스 태아의 복 부 표면에 있는2,5, 6,7. Notochordal 플레이트 형태학 상으로 anteriorly 노드3에서 emanates. 노드 및 notochordal 격판덮개에 각 셀 단일 cilium는 노드 셀에 긴 하지만 길이 따라 발달 단계2외부에 돌출 하는 특징 이다. 노드 구 덩이에 속눈썹의 회전 좌우 비대칭4를 결정 하는 신호에 대 한 중요 한 것을 보였다. Notochordal 플레이트 notochord, 인접 somites, overlying 신경 관3의 모방에 대 한 중요 한 신호 센터의 선구자 이다.
위치 (표면), 모양 (컵)와 고유한 외부 세포 구조 (속눈썹) 소지의 특성 때문에 sem의 전통적으로 사용 되었습니다 노드 및 notochordal 접시를 시각화 하 고 그들의 형성과 구조2, 연구 7. SEM는 또한 노드 자체 또는 gastrulation, morphogenesis, 뿐만 아니라 속눈썹 형성8,,910에 영향을 주는 돌연변이 셀에 속눈썹의 구조에 변화를 공부 하는 데 사용 됩니다. Sem의 전자가 생물 표본11등 재료의 외부 표면의 토폴로지 열 대권 외의 집중된 광선을 이용 하는 기술입니다. 샘플은 고정, 건조 하 고 스퍼터 코팅 금속 스캐닝 전자 현미경 관찰에 대 한 1 단계에서에서 설명 하는 대로.
WMIF는 유전자 제품, 단백질, 3 차원 (3D) 등을 시각화 하는 착 색 기술입니다. 조직, 기관 또는 전체 유기 체는 WMIF 신호 및 3d에서 결과 구조의 모양의 분포에 대 한 공간 정보를 제공합니다. 기술은 다음 형광 어원이 같은 말과 얼룩 샘플 고정 기반으로 합니다. 마우스 배아 ~ E7.5는 고 투명 작고 따라서 노드 및 notochordal 접시를 시각화 하기 위해 WMIF 프로토콜에 대 한 이상적인. 예를 들어 Barchyury (T) 핵 노드 및 notochordal 플레이트, 그리고 원시 조 흔, E7.5-E8 배아 개발 및 WMIF에 의해 T에 대 한 좋은 작업 항 체의 주위에 덜 정도로 표현 된다 전사 요소는 상업적으로 사용 가능한 착 절차를 가능 하 게 하 고. 노드 및 notochordal 플레이트의 셀 외부를 직면 하 고 따라서 형광 활용 Phalloidin 마크 F 걸 꼭대기 constrictions로 얼룩이 질 수 있다 압축된 꼭대기 표면 또한 특징입니다. 예제로이 시 약을 사용 하 여, T와 F-말라 WMIF에 의해 착 색의 조합 제공 합니다 노드 및 gastrulating 마우스 배아에 3d에서 notochordal 플레이트의 표현을 우리가 2 단계 8에서 보여줍니다. 그러나, 노드 및 notochordal 플레이트, FOXA2, 등의 다른 마커 뿐만 아니라 ARL13B 또는 acetylated tubulin, 속눈썹의 마커 개발 마우스 배아3,4, WMIF를 수행 하기 위해 또한 사용할 수 있습니다.
우리는 striatin 상호 작용 단백질 1 (STRIP1) 정상 gastrulation 및 마우스 배아8morphogenesis 필수적입니다 나타났습니다. STRIP1 striatin-상호 작용 가수분해 및 kinases 복합물 (STRIPAK), 우리와 다른 걸 골격 조직8,12에 연루가의 핵심 구성 요소입니다. Strip1 돌연변이 체 배아에 주요 결함 축 mesoderm (노드 및 notochordal 플레이트)의 형성과 antero 후부 몸 축의 확장에 있다. 우리는 우리가 대표 결과 에 해당 수치 표시 노드 및 야생-타입 (WT)와 Strip1 돌연변이 배아 notochordal 접시를 분석 하 SEM 및 WMIF를 이용 했다.
이 작품은, SEM 및 WMIF는 마우스 배아 노드 및 notochordal 접시를 시각화를 수행 하는 방법을 보여 줍니다. Gastrulating 마우스 배아의 작은 크기 ~ E7.5와 표면에 이러한 구조의 존재 그들을 이상적인 기술 설명된2,,78을 사용 하 여 공부 하 게. 좋은 항 체, T와 속눈썹 표식 등의 구조, 조직 및 이러한 필수 배아 주최8의 형성에 WMIF를 사용 하 여 우수한 3D 정보를 제공 합니다.
마우스 배아 개발은 매우 빠른 속도로 진행 되며 노드 및 notochordal 격판덮개만 정도 태아의 표면에 존재, 때문에 타이밍은 이러한 실험2,3의 성공을 위해 필수적입니다. 예를 들어 2-4 somite 배아는 긴 속눈썹과 성숙한 노드 구 덩이의 SEM 분석을 위해 좋다. 훨씬 이전 또는 이후 배아 (전이나 후에 예를 들어 12 h), 노드는 표면에 않을 수 있습니다. WMIF는이 점에서 좀 더 유연 하지만 스스로 구조는 또한 개발 하는 동안 과도 그리고 타이밍은이 경우에 연구자의 관심 분야에 따라 달라 집니다.
시 약의 순수성도 이러한 기술의 성공을 위해 필수적 이다 특히 열 대권 외의를 일반적으로 배아에 충실 SEM. 작은 불순물에 의해 조사 결과 거 대 한 유물에.
우리는 sem의 하나에 대 한 배아 정착의 두 가지 방법을 테스트 1 x PBS의 절반 Karnovsky의 정착 액 (2.5%도, 2 %paraformaldehyde 0.1 m M cacodylate 버퍼)와 간단 하 게 2.5%도 사용 하 여. 하지만 우리 글 및 PBS 정착 제 1 단계에에서 설명 된 대로 사용 하는 것을 선호, 우리와 다른 사용 해야, 또한 반 Karnovsky의 정착 액 성공적으로 SEM.에 대 한
우리는 또한 sem의 대 한 배아를 건조의 두 가지 방법에 비해 임계점 건조 기 또는 HMDS 1 단계에에서 설명 된 대로 사용 하 여 샘플의 품질에 차이가 발견 고14다른 곳에서 보고.
2 단계에 대 한 우리 1% 낮은 녹는 agarose의 최종 세척 단계 35 m m 유리 하단 접시에 장착 후 배아를 포함 하 고 다음 함께 그것을 토 핑 테스트 ~ 10 µ L 설치 매체의. 이 포함 하는 방법을 작동 하 고 태아의 원래 3 차원 구조 및 관련 된 구조; 그러나, multiphoton 현미경 표본 정기 confocal 현미경 그대로 배아로 깊은 도달할 수 없습니다 있기 때문에 이미지 하는 데 필요한 (~ 1 m m).
우리가 믿습니다 이러한 두 가지 기술을 사용 하 여 상호 보완적인 정보 노드와 notochordal 격판덮개의 구조에 정상적인 개발 하는 동안 이러한 구조의 형성에 결함을 표시 하는 돌연변이에.
The authors have nothing to disclose.
Hb 인지 의료 교수진 및 쾰른 대학교의 SFB829에서 시작 자금에 의해 지원 됩니다. C.X.은 DFG 지원 바 5810/1-1을 부여. 우리는 CECAD 연구 센터와 기념 슬로 안 Kettering 암 센터 (뉴욕, 미국) 이미징 시설 감사 하 고 싶습니다. WMIF에 대 한 배아를 장착 하는에 그의 통찰력에 감사 호아킨 Grego Bessa (스페인어 국립 센터 심장 혈관 연구, 마드리드, 스페인) 하 고.
1,1,1,3,3,3 Hexamethyldisilazane (HMDS) | Carl Roth | 3840 | |
Anti-T antibody | R&D Systems | AF2058 | |
Critical Point Dryer | Blazers Union | CPD 020 | |
DAPI | AppliChem | A4099,0005 | |
Glutardialdehyde solution 25% | Merck | 1042390250 | |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
Tween 20 | AppliChem | A4974,0500 | |
SEM coating unit PS3 | Agar Aids for Electron Microscopy | PS3 | |
SEM microscope Quantum FEG 250 | ThermoFisher Scientific (FEI) | Quantum FEG 250 |