Een anion wisselen hars gebaseerde methode, aangepast aan vloeistof impingement gebaseerde bioaerosol bemonstering van virussen is aangetoond. Wanneer gekoppeld aan downstream moleculaire detectie, zorgt de methode voor facile en gevoelige detectie van virussen van bioaerosols.
Dit protocol wordt een aangepaste bioaerosol bemonsteringsmethode voor virussen. Anion uitwisseling hars is in dit systeem, in combinatie met vloeibare impingement-gebaseerde air sampling apparaten voor effectieve concentratie van negatief geladen virussen van bioaerosols. Dus, de hars fungeert als een extra concentratie stap in de werkstroom bioaerosol bemonstering. Nucleïnezuur extractie van de virale deeltjes wordt vervolgens rechtstreeks vanuit de anion uitwisseling hars, met het resulterende monster geschikt voor moleculair analyses uitgevoerd. Verder, dit protocol beschrijft een custom-built bioaerosol kamer geschikt voor het genereren van virus-beladen bioaerosols onder een verscheidenheid van milieu-omstandigheden en rekening houdend met de continue monitoring van omgevingsvariabelen zoals temperatuur, vochtigheid, windsnelheid en de massaconcentratie aërosol. Het belangrijkste voordeel van het gebruik van dit protocol is verhoogde gevoeligheid van de detectie van virale, zoals beoordeeld via directe vergelijking met een ongewijzigde conventionele vloeibare impinger. Andere voordelen zijn het potentieel te concentreren divers negatief geladen virussen, de lage kosten van anion uitwisseling hars (~$0.14 per monster), en gebruiksgemak. Nadelen onder meer het onvermogen van dit protocol te beoordelen van de infectiviteit van hars-geadsorbeerde virale deeltjes, en potentieel de noodzaak voor de optimalisatie van de vloeistof bemonstering buffer gebruikt binnen de impinger.
Het doel van deze methode is een zeer gevoelige bioaerosol bemonstering platform om moleculaire detectie van virussen negatief geladen bioaerosols te bieden. Micro-organismen, met inbegrip van virale deeltjes, kunnen overleven in bioaerosols voor langere tijd1. Bioaerosols kunnen reizen over relatief lange afstanden en onderhouden van levensvatbaarheid en infectiviteit, zoals blijkt uit een uitbraak van veteranenziekte die afkomstig van industriële koeltorens zijn, gelegen op een afstand van 6 km van de getroffen personen en resulteerde in 18 doden2. Indirecte overdracht van virussen bij de mens gemedieerd door bioaerosols kan voorkomen in meerdere instellingen en heeft aangetoond voor uitbraken van norovirus in scholen en restaurants3,4. Evenzo, bioaerosol transmissie van virussen kan optreden in agrarische instellingen zoals in varkens en pluimvee boerderijen, met deze transmissie route wordt beschouwd als een belangrijke factor in het verkeer van virussen tussen productie faciliteiten5, 6 , 7 , 8 , 9.
Effectieve bemonstering van virus-beladen bioaerosols zorgt voor verbetering in de snelle diagnostiek en paraatheid in geval van uitbraak preventie, zoals wordt weergegeven in de demonstraties in welke H5 influenza een virussen werden waargenomen van bioaerosols in levende dier in China markten en de Verenigde Staten10,11. Huidige bioaerosol bemonstering technologieën omvatten een aantal verschillende deeltje vangen beginselen, en in grote lijnen kunnen worden onderverdeeld in impingers, cyclonen, botslichamen en filters,12. Het valt buiten het toepassingsgebied van dit protocol uitputtend voor alle voordelen en nadelen van deze platforms voor bemonstering van virussen van bioaerosols; echter kan worden gesteld dat de meerderheid van deze bemonstering apparaten niet zijn geoptimaliseerd voor het verzamelen van virussen en bacteriofagen13. Infectiviteit van virale deeltjes is bovendien vaak negatief beïnvloed, met vloeibare impingers beschouwd als virale infectiviteit effectiever dan bemonstering van apparaten zoals solid botslichamen of filters14handhaven. Een nadeel van vloeibare impingement is echter het doel verwateringseffect, die optreedt omdat virussen verzameld in relatief grote hoeveelheden (meestal ≥20 mL) vloeistof in het vat van de collectie worden. Een ander belangrijk nadeel houdt de suboptimaal efficiëntie van vloeibare impingers te concentreren deeltjes < 0,5 µM in grootte15. Echter is dat de efficiëntie van de opname van deze apparaten kan worden verbeterd door immobilisatie op solide matrices, zoals immobilisatie met behoud van virale nucleïnezuren en virale infectiviteit16,17 verbeteren kan.
Wij hebben eerder aangetoond dat anion uitwisseling hars een doeltreffend instrument voor het afvangen en de concentratie van virussen van vloeibare matrices is, met inbegrip van F-RNA bacteriofagen, hepatitis A-virus, menselijke adenovirus en rotavirus18,19 ,20. Zoals omschreven door de fabrikant, is de anion uitwisseling hars gebruikt in dit werk een macroreticular polystyreen sterke base anion uitwisseling hars waarin matiemaatschappij quaternaire amine groepen bemiddelen attractie en de verovering van anionen in een vloeibaar medium21 . Bijgevolg, het anion uitwisseling hars wordt verwacht te vangen van de virussen met net-negatieve oppervlakte kosten, met inbegrip van vele darmen virussen, influenzavirussen en andere virussen die relevant zijn voor de volksgezondheid en diergezondheid.
Het huidige protocol omvat de toevoeging van een vloeibare impinger hars anion uitwisseling. In dit systeem fungeert de hars als een secundaire concentratie stap voor virale deeltjes gevangen in de impinger vloeistof. Nucleic zuren kunnen dan direct in kleine volumes, een geconcentreerde steekproef te voorzien van moleculair analyses worden uitgewassen. Dus, het belangrijkste voordeel van deze methode is de verbetering van de gevoeligheid van de virale detectie, voornamelijk door middel van vermindering van monstervolume. Bovendien, als gevolg van de inherente aspecifieke verovering van negatief geladen virussen, de methode is waarschijnlijk die van toepassing zijn voor de detectie van een groot aantal virussen van belang. Hier is de methode voor de vaccinstammen van type A en type B-influenzavirussen en het FRNA coliphage MS2 (MS2) aangetoond. Deze virussen zijn later ontdekt met behulp van standaard qRT-PCR-testen als eerder beschreven22. De eindpunt-gebruiker moet niet verwachten dat problemen bij het uitvoeren van deze methode, omdat wijzigingen in de momenteel bestaande apparatuur vormen geen grote verstoringen van de conventionele stroom van bioaerosol bemonsterings- en analysemethoden.
Dit protocol beschrijft een methode voor gevoelige virale vangen van bioaerosols met behulp van gemodificeerde vloeibare impingers. De methode is geoptimaliseerd voor de detectie en kwantificering van de virale lading in bioaerosols. De specifieke wijziging hier gedemonstreerd omvat de toevoeging van vloeibare deel uitmaakt van een gemeenschappelijke vloeibare impinger hars anion uitwisseling. Deze methode werd ontwikkeld voor zijn eenvoud in verwerking stroomafwaarts monster, terwijl andere verwerkingstechnieken monster…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gesteund door de financiering van het CDC/NIOSH High Plains Intermountain centrum voor landbouw en gezondheid (5U54OH008085) en de Colorado Bioscience Discovery evaluatie Grant programma (14BGF-16).
Escherichia coli bacteriophage MS2 (ATCC 15597-B1) | American Type Culture Collection | ATCC 15597-B1 | |
FluMist Quadrivalent | AstraZeneca | Contact manufacturer | Viral constitutents of this vaccine are subject to change on an annual basis |
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855195 | |
Primers and probes | Integrated DNA Technologies | NA | |
0.2 µM sterile filter | NA | NA | |
1 L pyrex bottles or equivalent | NA | NA | |
1 mL pipet tips | NA | NA | |
1 mL pipettor | NA | NA | |
50 mL serological pipet | NA | NA | |
PCR tubes | NA | NA | |
Pipet-aid or equivalent | NA | NA | |
QIAamp Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52904 | |
QuantiTect Probe RT-PCR Kit | Qiagen | 204443 | |
Amberlite IRA-900 chloride form | Sigma-Aldrich | 216585-500G | |
Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
Water (molecular biology grade) | Sigma-Aldrich | W4502-1L | |
Eppendorf DNA LoBind Microcentrifuge Tubes | ThermoFisher | 13-698-791 | |
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | ThermoFisher | 14-432-22 | |
Falcon Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher | 05-538-62 | |
SuperScript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit w/ROX | ThermoFisher | 11745100 | |
SKC Biosampler 20 mL, 3-piece glass set | SKC Inc. | 225-9593 | |
Vac-u-Go sample pumps | SKC Inc. | 228-9695 | |
Collison nebulizer (6-jet) | BGI Inc. | NA | |
HEPA capsule | PALL | 12144 | |
Q-TRAK indoor air quality monitor 8554 | TSI Inc. | NA | |
Alnor velometer thermal anemometer AVM440-A | TSI Inc. | NA | |
SidePak AM510 personal aerosol monitor | TSI Inc. | NA | |
Bioaerosol chamber | NA | NA |