Aqui, apresentamos um protocolo para gerar um modelo de pele de esferoide melanoma de organotypic 3D que recapitula os dois a arquitetura e complexidade multicelular de um órgão/tumor na vivo , mas ao mesmo tempo acomoda sistemática experimental intervenção.
Transformação maligna dos melanócitos, as células de pigmento da pele humana, provoca a formação de melanoma, um câncer altamente agressivo com aumento potencial metastático. Recentemente, mono-quimioterapias continuam a melhorar por terapias de combinação específica de melanoma com inibidores da quinase específica. Ainda, melanoma metastático continua a ser uma doença fatal porque tumores exibem resistência primária ou desenvolvem resistência às terapias de romance, assim, recuperar a capacidade oncogenicidade. Para melhorar o sucesso terapêutico de melanoma maligno, a determinação dos mecanismos moleculares que confere resistência contra abordagens de tratamento convencional é necessária; no entanto, requer modelos inovadores celulares em vitro . Aqui, apresentamos um em vitro tridimensional (3D) organotypic melanoma esferoide modelo que pode retratar a arquitetura na vivo de melanoma maligno e pode justificar novos insights sobre intra-tumoral, bem como interações de tumor-hospedeiro. O modelo incorpora números definidos de esferoides melanoma maduras e diferenciadas em um modelo de reconstrução 3D da pele completo humano consistindo de células primárias da pele. O status de composição e de diferenciação celular de esferoides o melanoma incorporado é semelhante da metástase de melanoma cutâneo em vivo. Usar este modelo de esferoide de melanoma organotypic como uma plataforma de despistagem de drogas podem apoiar a identificação dos respondentes para selecionado terapias de combinação, poupando o fardo desnecessário tratamento de não-respondedores, aumentando assim o benefício de intervenções terapêuticas.
A pele humana é composta de dois compartimentos distintos que servem diferentes funções em proteger o corpo dos efeitos ambientais adversos1. O compartimento inferior dérmico consiste de um fibro-elástico do tecido conjuntivo. É composto por fibras de colágeno e elastina frouxamente ligadas sintetizadas pelos fibroblastos, servindo a uma função de barreira mecânica. A derme é separadoda da epiderme superior pela lâmina basal, que é produzida como uma matriz extracelular devido a uma comunicação constante entre os dois compartimentos de pele. Em contraste com a derme, a epiderme é um epitélio escamoso, que consiste principalmente de queratinócitos e pode ser diferenciada em quatro camadas. O estrato basale consiste de ceratinócitos basais indiferenciados que constantemente derivam de células progenitoras de pele estratificar através dos estágios do estrato granuloso e estrato spinosum no estrato córneo para proteger o corpo de infecções e desidratação2. Os melanócitos estão alinhados com a membrana basal e comunicam através de extensões dendríticas com vários queratinócitos. Que produzem a pigmento melanina para proteger o tecido da pele contra os efeitos nocivos da radiação UV, como o envelhecimento da pele, imunossupressão, inflamação e indução de câncer de pele não-melanoma. Contribuição de radiações UV para a transformação dos melanócitos de melanoma maligno, no entanto, ainda está em debate3.
Desenvolvimento de melanoma é diferenciado em fases de progressão do tumor diferente e caracterizado por certas mudanças genéticas, morfológicas e histológicas4. Eles se originam de qualquer de novo ou de um nevo inato ou adquirido devido a um local, aumento da proliferação de melanócitos causando neoplasia benigna. Esta lesão precursora pode converter em tecido displásico estruturalmente modificado, contendo células atypic, que podem continuar a primeira fase maligna, a fase de crescimento radial (RGP). Esta fase inicial de progressão de tumor é caracterizada por células proliferando radialmente dentro da epiderme, apresentando poucas células localmente invasivas dentro da derme papilar. Durante o melanoma de fase (VGP) subsequente crescimento vertical as células já apresentam um fenótipo invasivo e metastático através da lâmina basal para infiltrar as partes mais profundas da derme, bem como o tecido subcutâneo5da ruptura. Finalmente, o melanoma metastático (MM) representa o estágio de progressão mais agressivo com células metastáticas sistemicamente se espalhando em todo o sistema de sangue e da linfa para invadir a órgãos como o fígado, pulmão e cérebro6distalmente.
Até à data, diagnóstico precoce, seguido de cirurgia continua a ser a mais eficaz terapia de melanoma maligno. O prognóstico para pacientes com metástase à distância, no entanto, continua a ser particularmente pobre7, porque os regimes de quimioterapia clássica conferem apenas pequena sobrevivência benefício8,9. No entanto, depois de décadas de estagnação, avanços recentes em terapias alvo têm melhorado consideravelmente o prognóstico do melanoma maligno.
Hipotalâmica de duas vias principais mitógeno ativado, o RAS-RAF-MEK-ERK e as vias de sinalização de PI3K-AKT-PTEN, apresentam impulsores-chave de progressão do melanoma, especialmente quando constitutivamente ativando mutações pontuais de BRAFV600 os proto-oncogenes e ARN são presentes10. Nesse sentido, a invenção de inibidores da quinase alvo prometido benefício terapêutico para pacientes que sofrem de melanoma metastático. Uma infinidade de ensaios clínicos realizados a este ponto não tem alcançado significativo benefício para pacientes com melanoma metastático. Quase todas as respostas são parciais, com uma subpopulação de pacientes mostrando resistência primária. Além disso, observou-se a aquisição da resistência secundária, levando a recaída na maioria dos pacientes11,12.
Torna-se claro que a análise do estado de mutação sozinho não é suficiente para desenvolver a estratégia terapêutica mais potente. Novas ferramentas de diagnóstico rápidas e confiáveis são necessárias para sistematicamente registar e analisar a capacidade de resposta das células cancerosas individuais. A grande maioria dos dados disponíveis atualmente no melanoma humano foram Obtida de culturas de células de melanoma (2D) bidimensional. Células tumorais, no entanto, crescidas em 3D permitem intercelular crosstalk entre câncer diferenciado subpopulações de células, bem como entre as células cancerosas e o tecido do hospedeiro circundante não-transformadas. Portanto, seria melhor reconstruir o ambiente 3D, em que o melanoma desenvolvido, para ser usado como um rastreio pré-clínico modelo13,14.
O modelo de pele esferoide de melanoma organotypic introduzido aqui garante novas perspectivas para uma compreensão mais profunda de intra-tumoral e interação de tumor-hospedeiro e pode fornecer uma plataforma de triagem avançados para estudar os mecanismos moleculares do desenvolvimento do tumor e resistência de terapia no futuro.
Para garantir o melhor fisiológica e na vivo simulando condições de pele reconstrói, a qualidade das células primárias é de extrema importância. Como dito acima, as células de pele juvenil ou pré-natal mostram o grau de diferenciação menor e são, portanto, melhor adequadas para gerar equivalentes de pele de espessura total. O primeiro controle de qualidade possível é a extensão da contração dérmica no 2º dia após a semeadura os queratinócitos e desenroscada do gel a EGM (seções de protocolo 8.2 e 8.3). Géis dérmicas vão encolher ao máximo com a melhor qualidade dos fibroblastos. Também, a integração de poucos ou muitos fibroblastos pode afectar dérmica contração e, consequentemente, a penhora de epidérmico ao compartimento dérmica. Isto por sua vez irá comprometer a diferenciação epidérmica, porque este processo requer uma extensa conversas cruzadas entre células dérmicas e epidérmicas.
A qualidade das células primárias também depende muito da confluência de célula, bem como a passagem das células. Se os queratinócitos são cultivados para ≥ 80% confluência eles imediatamente parem se proliferando e começarem a diferenciar. Portanto, é importante a cultura da confluência de 40-70% durante a passagem e usá-los não mais tarde do que passagem 3-4. Fibroblastos são menos sensíveis, mas não devem ser usados mais tarde do que a passagem de 4-6. Observe também que todas as células primárias e linhagens celulares utilizadas para gerar modelos de pele de esferoide de melanoma organotypic são cultivadas livres de antibióticos, e, portanto, o risco de contaminação é alto. No entanto, a adição de antibióticos altera a fisiologia das células individuais e, portanto, reduz a qualidade do equivalentes a pele.
Em geral, a formação de tumor esferoide é possível de quase todos os tipos de linhas de células de tumor e também de células tumorais recém isoladas de material paciente. O tempo de número e/ou cultivo de célula inicial para obter tamanhos de esferoide ideal pode variar dependendo do tipo de célula usado. Até um tamanho de 150-200 µm, todas as células incluídas em um esferoide ainda podem ser fornecidas suficientemente com nutrientes através de simples difusão. Esferoides só com tamanhos ≥500 µm mostram um alto grau de diferenciação celular e representam as características típicas de tumor avasculares tecido22.
O organotypic melanoma-esferoide-pele-modelo desenvolvido aqui é particularmente adequado para estudar interações do tumor-hospedeiro e por debaixo na vivode testes de drogas de melanoma-como condições15. Ainda assim, o ambiente do melanoma na vivo é ainda mais complexo, abrigando uma variedade de tipos de células de tumor associado, incluindo as células imunes e células endoteliais. Desde que a adição de células do sistema imune primárias adequadas enfrenta problemas com histocompatibilidade, esses modelos ainda não são capazes de monitorar adequadamente abordagens terapêuticas-imune.
Não obstante, esferoides de melanoma podem ser gerados a partir de material paciente recém isolada e uma vez incluídos em reconstruir a pele cheia, pode servir como droga individual triagem plataformas. Mesmo a integração de peças de metástase de melanoma na pele reconstrói é concebível para testar combinações de drogas em uma abordagem terapêutica sob medida. Incluindo o modelo de pele-melanoma 3D organotypic em testes pré-clínicos é susceptível de ajudar a garantir que somente os mais promissores novos conceitos terapêuticos são tidos para a frente em ensaios clínicos, reduzindo assim a taxa de abandono de potenciais novos tratamentos para este doença e aumentando a taxa de sucesso terapêutico em ensaios clínicos.
The authors have nothing to disclose.
Os autores graças a Hanna Voersmann para estabelecer o melanoma-esferoide-pele-modelo 3D organotypic e proporcionando excelentes protocolos. Os autores também agradecer Silke Busch valioso suporte técnico. O trabalho foi apoiado pelo BMBF e: programa Med 031A423A “Sensibilidade de Melanoma”.
fetal serum albumin (FCS) | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | add 10 % to cell culture medium |
Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | 1X dilute in PBS |
RPMI | Thermo Fisher Scientific | 61870010 | for cultivation of melanoma cell lines |
DMEM | Thermo Fisher Scientific | 41965062 | for cultivation of primary fibroblasts |
Dispase | Gibco life technologies | 17105041 | 2U/ml, dissolve in PBS |
Collagen type I | BD Biosciences | 354249 | usually from rat tail, concentration should be 3.5-4 mg/ml |
24-well inserts Nunclon | Nunc | 140629 | 8 µm pore size; use standing, not hanging inserts! |
cell strainer | BD Falcon | 352360 | yellow |
Gentamycine | Thermo Fisher Scientific | 15750060 | dissolve in PBS |
Keralife keratincyte medium | Cell Systems | do not add FCS or antibiotics | |
Collagenase | SERVA | 17454 | NB4 standard grade |
juvenile human keratinocytes | Cell Systems | FC-0007 | alternative to own preparation from juvenile foreskin |
juvenile human fibroblasts | Cell Systems | FC-0001 | alternative to own preparation from juvenile foreskin |
DMEM [+] 4,5 g/l Glucose, [+] L- Glutamine, [-] L- Pyruvate |
Gibco life technologies | 41965 | mix 1:1 with Ham´s F-12 for MM medium; mix 3:1 with Ham´s F-12 for EGM medium |
Ham´s F-12 [+] L-Glutamine | Gibco life technologies | 21765-029 | add to DMEM for the generation of EGM and MM medium (see lane 15) |
EGF | Gibco life technologies | 13247-051 | add 10 ng/ml only for the generation of EGM medium |
Calcium chloride | Merck Chemicals | 2381 | add 1.9 mM for the generation of EGM and 3.8 mM for MM medium |
Selenic acid | Alfa Aesar | 18851 | add 53 nM for the generation of EGM and MM medium |
Insulin | Lilly | HI0219 Hum Pen 3ml 100 E.I./ml | add 5 µg/ml for the generation of EGM and MM medium |
Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E-0135 | add 0.1 mM for the generation of EGM and MM medium |
P-Ethanolamine | Sigma-Aldrich | P-0503 | add 0.1 mM for the generation of EGM and MM medium |
Holo-Transferrine | Sigma-Aldrich | T-0665 | add 5 µg/ml for the generation of EGM and MM medium |
Triiodthyronine | Sigma-Aldrich | T-6397 | add 20 pM for the generation of EGM and MM medium |
Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H-088816 | add 0.4 µg/ml for the generation of EGM and MM medium |
Progesterone | Sigma-Aldrich | P-8783 | add 10 nM only for the generation of EGM medium |
Hepes | Sigma-Aldrich | H-3784 | add 15 mM for the generation of EGM and MM medium |
Serine | Sigma-Aldrich | S-4311 | add 1 mM for the generation of EGM and MM medium |
Cholinchloride | Sigma-Aldrich | C-7017 | add 0.64 mM for the generation of EGM and MM medium |
dFCS | Sigma-Aldrich | F-0392 Lot 086K0361 | add 2 % for the generation of EGM and MM medium |
Adenine | Sigma-Aldrich | A-9795 | add 0.18 mM for the generation of EGM and MM medium |
L-Glutamine | PromoCell | C-42209 | add 7.25 mM for the generation of EGM and MM medium |
Strontiumchloride | Sigma-Aldrich | 255521 | add 1 mM for the generation of EGM and MM medium |
anti cytokeratin 10 antibody | Dako | M7002 | 1:50 |
anti cytokeratin 14 antibody | Santa Cruz | sc-53253 | 1:200 |
anti laminin 5 antibody | Santa Cruz | sc-32794 | 1:50 |
anti filaggrin antibody | Thermo Fisher Scientific | MA5-13440 | 1:50 |
anti involucrin antibody | Acris Antibodies | AM33368PU | 1:50 |
secondary polyclonal goat anti-mouse IgG FITC labeled | LifeSpan Biosciences | LS-C153907 | 1:50 |
secondary polyclonal goat anti-mouse IgG Cy3 labeled | Jackson Immuno Research | 115-165-003 | 1:1000 |
DAPI | Sigma-Aldrich | 10236276001 | 1:100 |