在这里, 我们提出一个协议来生成一个3D 脊髓黑色素瘤球形皮肤模型, 概括的结构和多细胞复杂性的器官/肿瘤在体内, 但同时容纳系统实验干预。
黑色素细胞的恶性转化, 人类皮肤的色素干细胞, 导致黑素瘤的形成, 一种高度侵袭性的癌症, 增加转移潜能。最近, 单化疗继续改善由黑色素瘤特定的组合疗法与靶向激酶抑制剂。然而, 转移性黑色素瘤仍然是一种危及生命的疾病, 因为肿瘤表现出主要的抵抗力或发展抗新疗法, 从而恢复癌变能力。为了提高恶性黑色素瘤的治疗成功率, 有必要确定分子机制, 以抵抗常规治疗方法;但是, 它需要创新的蜂窝体外模型。在这里, 我们介绍一个体外三维 (3D) 脊髓黑色素瘤球形模型, 它可以刻画恶性黑色素瘤的体内体系结构, 并可能对肿瘤内和肿瘤宿主相互作用有新的洞察力。该模型纳入了定义的数量成熟和分化黑色素瘤球体在一个3D 人全皮肤重建模型, 由主要皮肤细胞组成。嵌体黑色素瘤球体的细胞组成和分化状况与皮肤黑色素瘤转移在体内相似。利用这种脊髓黑色素瘤球形模型作为药物筛选平台, 可以支持对选择的组合疗法的应答者的识别, 同时又能为非应答者节省不必要的治疗负担, 从而提高治疗干预。
人体皮肤由两个不同的隔间组成, 在保护身体免受不良环境影响的情况下1。下真皮室由纤维弹性结缔组织组成。它由松质连接的胶原蛋白和纤维蛋白合成的弹力纤维素组成, 为机械屏障功能服务。真皮与上表皮分离, 基底叶片是由于两个皮肤间的恒定通信而产生的细胞外基质。与真皮相比, 表皮是一种鳞状上皮, 主要由角质形成, 可分化为四层。地层 basale包括未分化的基底角质形成细胞, 它不断地从皮肤祖细胞分层通过地层棘和层 granulosum进入角质层的阶段. 保护身体不受脱水和感染2。黑色素细胞在基底膜上排列, 通过树突状延伸与多个角质形成沟通。他们生产色素黑色素, 以保护皮肤组织免受紫外线辐射的不利影响, 如皮肤老化, 免疫抑制, 炎症, 并诱导非黑色素瘤皮肤癌。然而, 紫外线辐射对黑色素细胞转化为恶性黑色素瘤的贡献仍在辩论中3。
黑色素瘤的发展被区分成不同的肿瘤进展阶段, 并以一定的遗传、形态学和组织学变化为特征4。它们起源于从头或从先天或获得的痣, 由于局部增加的黑色素扩散造成良性的肿瘤。这种前体病变可转化为结构改良的肝硬化组织, 含有 atypic 细胞, 可能持续到第一个恶性阶段, 即径向生长阶段 (RGP)。这个早期的肿瘤进展阶段的特点是细胞在表皮内呈放射状增殖, 在乳突真皮内几乎没有局部侵入细胞。在随后的垂直生长阶段 (VGP) 黑色素瘤细胞已经显示了转移和侵入性表型通过打破基底层, 渗透到真皮的更深部分以及皮下组织5。最后, 转移性黑色素瘤 (MM) 代表最积极的进展阶段, 转移细胞系统地扩散到整个血液和淋巴体系侵入远端器官, 如肝, 肺和大脑的6。
迄今为止, 早期诊断和手术仍然是恶性黑色素瘤最有效的治疗方法。然而, 远距离转移患者的预后仍然特别差7, 因为经典化疗方案只授予很少的生存好处8,9。然而, 经过数十年的停滞, 最近在靶向治疗的进展大大改善了恶性黑色素瘤的预后。
失调两个主要的丝裂原活化通路, RAS-皇家空军-PI3K-AKT-PTEN 和信号通路, 是黑色素瘤进展的关键驱动因素, 特别是当组成性激活点突变的原始癌基因 BRAFV600 和NRAS 当前10。因此, 靶向激酶抑制剂的发明承诺治疗转移性黑色素瘤患者的疗效。在这一点上进行的许多临床试验对转移性黑色素瘤患者没有取得显著的好处。几乎所有的反应都是局部的, 有一个亚群的患者显示主要的抵抗。此外, 大多数患者在11、12中观察到了导致复发的二次耐药性的获得。
很明显, 单纯的变异状态分析不足以形成最有效的治疗策略。为了系统记录和分析单个癌细胞的反应能力, 需要新的快速、可靠的诊断工具。目前可获得的关于人类黑色素瘤的绝大多数数据都是从二维 (2D) 黑色素瘤细胞培养得到的。然而, 肿瘤细胞在3D 生长, 允许分化癌细胞亚群之间的细胞间串扰以及癌细胞与非转化的周围宿主组织之间的相互干扰。因此, 最好重构黑色素瘤开发的3D 环境, 用作临床前筛选模型13,14。
本文介绍的脊髓黑色素瘤球形皮肤模型, 为深入了解肿瘤内和肿瘤宿主相互作用提供了新的见解, 并可为研究肿瘤发展的分子机制和未来的治疗耐药性。
为了保证最佳的生理和体内模拟皮肤重建的条件, 主要细胞的质量是至关重要的。如上所述, 幼年或产前皮肤细胞表现出最低的分化等级, 因此最适合生成全厚度皮肤当量。第一个可能的质量控制是皮肤萎缩的程度在2天后, 播种角质细胞和平衡凝胶到 EGM (协议节8.2 和 8.3)。真皮凝胶将最有效地收缩成纤维细胞的质量。此外, 太少或太多的成纤维细胞的整合可能会损害皮肤收缩, 从而将表皮附着到真皮间。这反过来会损害表皮分化, 因为这个过程需要在真皮和表皮细胞之间进行广泛的交叉交谈。
主要细胞的质量也取决于细胞融合以及细胞的通过。如果角质形成细胞生长到≥80% 融合他们立即停止增殖和开始分化。因此, 在传代期间将它们培养到 40-70% 融合是很重要的, 并且不迟于通过 3-4 的时间使用它们。成纤维细胞较不敏感, 但不应使用较晚于 4-6。还请注意, 用于生成脊髓黑色素瘤球形皮肤模型的所有主要细胞和细胞系均无抗生素培养, 因此污染风险很高。然而, 抗生素的添加改变了个体细胞的生理, 从而降低了皮肤当量的质量。
一般来说, 肿瘤球体的形成是可能的几乎所有类型的肿瘤细胞系, 也从肿瘤细胞新鲜分离的病人材料。获得最佳球体尺寸的初始细胞数和/或培养时间可能因所使用的细胞类型而异。高达 150-200 µm 的大小, 所有在球体中的细胞仍然可以通过简单的扩散充分提供养分。只有球体大小≥500µm 显示高度的细胞分化, 代表非血管瘤组织的典型特征22。
在这里开发的脊髓黑色素瘤-球形皮肤模型特别适合研究肿瘤宿主相互作用和黑色素瘤药物测试在体内样情况下15。然而, 黑色素瘤的环境,在体内更复杂, 窝藏各种肿瘤相关的细胞类型, 包括免疫细胞和内皮细胞。由于适当的初级免疫细胞的添加面临着组织相容性的问题, 这些模型尚不能充分监测免疫治疗方法。
然而, 黑色素瘤球体可以由新鲜隔离的病人材料产生, 一旦纳入完整的皮肤重建, 可以作为个别的药物筛选平台。即使将黑色素瘤转移到皮肤重建中, 也可以用一种量身定做的治疗方法来测试药物组合。包括脊髓3D 皮肤黑色素瘤模型在临床前试验中可能有助于确保只有最有前途的新的治疗概念, 以进行的医疗测试, 从而降低了潜在的新疗法的磨损率疾病和提高治疗成功率的临床试验。
The authors have nothing to disclose.
作者感谢汉娜 Voersmann 建立了3D 脊髓黑色素瘤-球形皮肤模型, 并提供了优良的协议。作者还感谢 Silke 布希提供了宝贵的技术支持。这项工作得到了 BMBF e: 医学项目 “黑色素瘤敏感性” 031A423A 的支持。
fetal serum albumin (FCS) | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | add 10 % to cell culture medium |
Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | 1X dilute in PBS |
RPMI | Thermo Fisher Scientific | 61870010 | for cultivation of melanoma cell lines |
DMEM | Thermo Fisher Scientific | 41965062 | for cultivation of primary fibroblasts |
Dispase | Gibco life technologies | 17105041 | 2U/ml, dissolve in PBS |
Collagen type I | BD Biosciences | 354249 | usually from rat tail, concentration should be 3.5-4 mg/ml |
24-well inserts Nunclon | Nunc | 140629 | 8 µm pore size; use standing, not hanging inserts! |
cell strainer | BD Falcon | 352360 | yellow |
Gentamycine | Thermo Fisher Scientific | 15750060 | dissolve in PBS |
Keralife keratincyte medium | Cell Systems | do not add FCS or antibiotics | |
Collagenase | SERVA | 17454 | NB4 standard grade |
juvenile human keratinocytes | Cell Systems | FC-0007 | alternative to own preparation from juvenile foreskin |
juvenile human fibroblasts | Cell Systems | FC-0001 | alternative to own preparation from juvenile foreskin |
DMEM [+] 4,5 g/l Glucose, [+] L- Glutamine, [-] L- Pyruvate |
Gibco life technologies | 41965 | mix 1:1 with Ham´s F-12 for MM medium; mix 3:1 with Ham´s F-12 for EGM medium |
Ham´s F-12 [+] L-Glutamine | Gibco life technologies | 21765-029 | add to DMEM for the generation of EGM and MM medium (see lane 15) |
EGF | Gibco life technologies | 13247-051 | add 10 ng/ml only for the generation of EGM medium |
Calcium chloride | Merck Chemicals | 2381 | add 1.9 mM for the generation of EGM and 3.8 mM for MM medium |
Selenic acid | Alfa Aesar | 18851 | add 53 nM for the generation of EGM and MM medium |
Insulin | Lilly | HI0219 Hum Pen 3ml 100 E.I./ml | add 5 µg/ml for the generation of EGM and MM medium |
Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E-0135 | add 0.1 mM for the generation of EGM and MM medium |
P-Ethanolamine | Sigma-Aldrich | P-0503 | add 0.1 mM for the generation of EGM and MM medium |
Holo-Transferrine | Sigma-Aldrich | T-0665 | add 5 µg/ml for the generation of EGM and MM medium |
Triiodthyronine | Sigma-Aldrich | T-6397 | add 20 pM for the generation of EGM and MM medium |
Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H-088816 | add 0.4 µg/ml for the generation of EGM and MM medium |
Progesterone | Sigma-Aldrich | P-8783 | add 10 nM only for the generation of EGM medium |
Hepes | Sigma-Aldrich | H-3784 | add 15 mM for the generation of EGM and MM medium |
Serine | Sigma-Aldrich | S-4311 | add 1 mM for the generation of EGM and MM medium |
Cholinchloride | Sigma-Aldrich | C-7017 | add 0.64 mM for the generation of EGM and MM medium |
dFCS | Sigma-Aldrich | F-0392 Lot 086K0361 | add 2 % for the generation of EGM and MM medium |
Adenine | Sigma-Aldrich | A-9795 | add 0.18 mM for the generation of EGM and MM medium |
L-Glutamine | PromoCell | C-42209 | add 7.25 mM for the generation of EGM and MM medium |
Strontiumchloride | Sigma-Aldrich | 255521 | add 1 mM for the generation of EGM and MM medium |
anti cytokeratin 10 antibody | Dako | M7002 | 1:50 |
anti cytokeratin 14 antibody | Santa Cruz | sc-53253 | 1:200 |
anti laminin 5 antibody | Santa Cruz | sc-32794 | 1:50 |
anti filaggrin antibody | Thermo Fisher Scientific | MA5-13440 | 1:50 |
anti involucrin antibody | Acris Antibodies | AM33368PU | 1:50 |
secondary polyclonal goat anti-mouse IgG FITC labeled | LifeSpan Biosciences | LS-C153907 | 1:50 |
secondary polyclonal goat anti-mouse IgG Cy3 labeled | Jackson Immuno Research | 115-165-003 | 1:1000 |
DAPI | Sigma-Aldrich | 10236276001 | 1:100 |