우리는 각막 기증자 기질의 고품질 평가를 위한 방법으로 전체 필드 광학 간섭 현미경의 사용을 설명합니다. 이 프로토콜은 건강 또는 질병을 나타내는 특징을 식별하는 데 사용할 수 있으며 기증자 조직의 스크리닝 및 선택, 따라서 각막 성형술의 결과를 개선하는 것을 목표로 합니다.
전체 각막 두께의 약 90%를 차지하는 기증자 각막 기질의 질은 심부 전방 층상 및 관통 각막 성형술의 성공을 위한 주요 제한 요인 중 하나일 가능성이 높습니다. 이것은 병든 각막층의 일부 또는 전부를 최근에 사망한 개인에게서 채취한 기증된 조직인 이식편으로 각각 교체하는 수술 절차입니다. 그러나 안구 은행에서 각막 이식편의 기질 품질을 평가하는 수단은 제한적이며 질병 지표의 고해상도 정량적 평가 기능이 부족합니다. 신선하거나 고정된 생체 외 생물학적 조직 샘플의 고해상도 3D 이미징을 허용하는 FF-OCM(Full-Field Optical Coherence Microscopy)은 기증자 각막 평가에 매우 적합한 비침습적 기술입니다. 여기에서는 FF-OCM을 사용하여 각막 간질의 정성 및 정량 분석 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 정상 기증자 각막과 병리학적 각막 버튼에 성공적으로 적용되었으며 거시적 및 미시적 수준 모두에서 건강하고 병리학적인 특징을 식별하는 데 사용할 수 있으므로 각막 성형술의 결과를 손상시킬 수 있는 간질 장애의 감지를 용이하게 합니다. 이식편 품질 관리를 개선함으로써 이 프로토콜은 기증자 조직의 더 나은 선택(및 거부)을 초래하여 이식 실패를 줄일 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.
각막 질환은 전 세계적으로 실명의 주요 원인 중 하나입니다1. 일부 질병은 수술로만 치료할 수 있으며, 종종 최근에 사망한 개인에게서 채취한 기증된 조직인 이식편에 의해 병든 각막의 일부(즉, 층상 각막 성형술) 또는 전체(즉, 관통 각막 성형술)를 교체하는 것을 포함합니다. 내피에 영향을 미치지 않는 각막 질환(예: 원추각막, 감염성 각막염 후 기질 흉터, 외상 및 기질 이영양증)의 경우 심부 전방 층상 각막 성형술(DALK)이 현재 선택 수술 기법으로 간주됩니다 2,3,4,5. 이 기술은 이식 거부 반응의 낮은 발생률, 내피 거부의 부재, 낮은 내피 세포 손실 및 유리한 비용 효율성 비율과 관련된 중심 각막 상피 및 간질만을 대체함으로써 수혜자의 각막 내피의 보존을 가능하게 합니다 6,7,8,9,10,11 . DALK는 또한 최적의 내피 품질이 낮은 각막을 이식편으로 사용할 수 있도록 하는데, 이는 이 손상된 층이 이식되지 않기 때문이다12. 반대로, 기증자 각막 간질의 질은 간질이 남아 있는 유일한 기증자 각막층인 반면 기증자 상피는 수혜자 상피로 대체되기 때문에 이식 성공 및 시력 회복의 주요 제한 요인이 될 수 있습니다. 불행히도 안구 은행에서 기증자 각막 기질을 평가하는 수단은 제한적입니다. 여기에는 일반적으로 적출술에 의한 조직 회수 시 기증자 안구의 세극등 검사와 기증자 기질의 광학 현미경 검사가 포함된다13. 일부 안구 은행은 푸리에 영역 광간섭 단층촬영(FD-OCT)을 사용하여 이러한 표준 절차를 보완하기 시작했습니다14.
초음파 영상(15)에 대한 광학 아날로그인 안과 광간섭 단층촬영(OCT)은 광대역 또는 조정 가능한 광의 간섭을 사용하여 망막(16 ) 및 전안분(17)의 광학 섹션을 생성한다. 초기 임상 시스템의 기초인 시간 영역 OCT에서는 참조 미러의 위치가 변경되어 참조 빔이 다양한 조직 계면에서 반사된 빔과 거의 동일한 시간을 이동할 때마다 간섭 패턴이 나타나고 A-스캔은 시간의 함수로 생성됩니다. 대부분의 현대 임상 시스템의 기초가 되는 FD-OCT(스펙트럼 또는 주파수 영역 OCT라고도 함)에서는 참조 미러가 한 위치에 고정되고 모든 간섭 패턴이 혼합된 개별 A-스캔이 한 번에 획득되고 푸리에 분석을 통해 해부됩니다.
임상(시간 또는 스펙트럼 영역) OCT 시스템은 각막의 단면도를 허용하고 세극등 생체현미경보다 더 높은 축 분해능에서 기질 혼탁을 감지할 수 있지만 측면 분해능은 제한적입니다. 공초점 현미경(18 )은 조직학적 세부사항에 접근하는 측면 해상도에서 각막의 검사를 허용하지만, 축으로 제한된다.
전장 광간섭 단층 촬영 현미경(FF-OCT 또는 FF-OCM)19,20은 컨포칼 현미경과 OCT의 요소를 결합하여 약 1μm의 축 분해능에 필적하는 측면 분해능을 달성합니다. 보다 구체적으로, FF-OCM은 비간섭성 광대역 광원(예: 할로겐 램프)과 높은 개구 광학을 사용하여 측면 스캐닝 없이 얼굴 2D 단층 촬영 이미지를 획득합니다. 깊이 방향으로 스캔함으로써 FF-OCM은 신선하거나 고정된 생체 외 생물학적 조직 샘플의 비침습적 3D 이미징을 가능하게 합니다. 각막21,22,23을 이미지화하는 데 사용되었습니다. 고해상도 en 얼굴 및 단면도를 모두 제공함으로써 FF-OCM은 각막의 조직학적 구조와 세포 세부 사항에 대한 정보를 제공합니다. 사실, FF-OCM은 조직학보다 우수한 구조 정보를 제공하는 것으로 나타났으며 스펙트럼 도메인 OCT와 공초점 현미경의 조합으로 가능한 한 더 많은 질병 지표를 식별할 수 있었습니다24,25.
여기에서는 FF-OCM을 사용하여 각막 기증자 기질의 정성적 및 정량적 평가를 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 세 가지 정량적 기질 매개변수(즉, Bowman의 층 두께 및 가변성, 기질 반사율)를 포함하여 기질 상태를 나타내는 거시적 및 현미경적 특징의 조직학과 유사한 분석을 기반으로 합니다. 따라서 설명된 프로토콜은 정상 및 비정상 각막 조직에 적용되며 병에 걸린 인간 각막 조직과 정상 인간 각막 조직의 분화를 허용합니다.
FF-OCM을 사용한 각막 기증자 기질의 정성적 및 정량적 평가를 위해 여기에 설명된 프로토콜은 스펙트럼 영역 OCT 및 공초점 현미경21,24,25의 기능을 넘어 기질 상태를 나타내는 거시적 및 현미경적 특징의 조직학과 유사한 분석을 기반으로 하며 질병에 걸린 사람을 정상 인간 조직과 구별할 수 있습니다.
정반사 현미경을 통한 인간 기증자 각막의 우수한 내피 품질 평가 외에도 안구 은행에서 기질 품질 평가는 어려운 일이며 일반적으로 현재 프로토콜에서 세극등 생체현미경 및/또는 광학 현미경을 사용한 전체 관찰로 제한됩니다. 기존 방법으로는 미세한 해상도가 없다는 것은 각막 성형술의 결과를 손상시키는 일부 기질 질환이 있는 각막이 선택될 수 있다는 것을 의미할 뿐만 아니라, 전방 기질 또는 상피 부위에 실제로 제약이 되는 기질 혼탁으로 인해 각막이 거부될 수 있으며 내피 각막 성형술에 여전히 사용될 수 있음을 의미한다14.
현재의 안구 은행 프로토콜은 FF-OCM의 추가로 보완될 수 있으며, 이는 우수한 해상도로 인해 각막, 특히 간질(Bowman’s layer 포함)의 품질 평가를 완료하는 강력하고 비침습적인 도구를 구성합니다. 세극등 검사와 달리 이식편은 FF-OCM 이미지 획득 전반에 걸쳐 저장 매체로 채워진 밀폐된 챔버에 잠겨 있어 잠재적인 오염 위험을 줄입니다.
FF-OCM을 사용한 성공적인 이미지 획득( 재료 표 참조)을 위해서는 현미경 대물렌즈가 샘플 홀더의 커버슬립 위에 도포된 광학 젤에 잘 잠겨 있어야 합니다(2.2.3단계). 또한 장치의 교정을 정기적으로 점검하는 것이 좋으며, 자동 조정에 실패한 후(2.2.2단계) 수집 소프트웨어의 “도구 및 옵션”을 통해 액세스할 수 있는 절차입니다( 재료 표 참조). 샘플 홀더에 교정 미러를 사용하는 절차는 커버슬립을 배치하기 전에 광학 젤을 미러에 도포해야 한다는 점을 제외하면 일반적인 샘플 준비(1.2단계 참조)와 동일합니다.
기존 안구 은행 절차에 따라 정상 간질을 갖는 것으로 간주되는 일련의 기증자 각막 이식편을 사용하여 이 원고의 프로토콜을 설명하고 기증자 기질 품질의 정확하고 신뢰할 수 있는 평가를 위한 FF-OCM의 적합성을 구체적으로 입증했습니다. 이러한 정상 기증자 각막은 저장 배지에 담근 병리학적 각막과 비교되었으며, 이는 각막 이식편에서 여러 기질 특징(그림 2, 그림 3, 그림 4, 그림 5, 그림 6, 그림 7 및 그림 8)의 FF-OCM으로 조직학적 유사 분석이 가능함을 보여줍니다.
흉터(그림 5 및 그림 7), 섬유성 조직(그림 8), 호수(그림 2), Vogt striae(그림 4) 또는 증가된 기질 신경 직경(그림 4)의 존재와 같은 형태학적 변화를 제외하고, 병든 각막에는 전형적인 기질 특징이 존재합니다. 기질 품질 평가와 특히 관련된 기질 매개변수는 Bowman의 층 두께와 그 가변성, 기질 반사율인 것으로 보입니다. 따라서 프로토콜 내의 중요한 단계는 4.1 및 4.3 단계입니다.
인간의 각막 발달 중에 분비되는 반면, 특히 Bowman의 층은 임신 19 주까지 뚜렷 해지고 출생 후에는 결코 회복되지 않습니다32. 따라서 Bowman 층의 손상은 돌이킬 수 없으며 굴절 수술, 감염성 각막염, 원추 각막으로 인한 손상을 포함하여 기증자 각막 조직의 이전 간질 손상의 이상적인 지표 역할을 합니다. 기증자 각막 사용에 대한 금기 사항을 구성하는 이러한 각막 질환은 중단 및 흉터로 인한 Bowman’s layer 두께 감소 및 가변적인 것과 관련이 있으며(그림 5), 기증자 이력이 정확히 알려지지 않은 경우 현재 안구 은행 프로토콜에서 놓칠 가능성이 있습니다.
사후 각막 부종으로 인해 기증자 사망 후 각막 투명도가 손상되지만, 후방 산란광의 양 또는 기질 반사율은 기질의 깊이에 따라 기하급수적으로 감소할 것으로 예상됩니다(그림 3 및 그림 4A 참조). 결과적으로, 정규화된 기질 반사율의 로그는 1에 가까운 R-제곱 값으로 표시되는 정상 기증자 각막의 기질 깊이의 선형 함수가 될 것입니다. 반대로, 거시적 특징의 존재는 비선형 로그 깊이 프로파일과 관련이 있으며 기질 질환을 나타냅니다(그림 4B 및 그림 7)25.
각질세포 밀도는 기질 콜라겐 원섬유와 세포외 기질 합성 및 재생을 담당하기 때문에 각질세포 밀도가 기증자 기질 품질을 평가하기 위한 또 다른 관련 매개변수이며 매우 낮은 각질세포 수를 나타내는 조직은 이식해서는 안 된다고 가정하는 것이 합리적으로 보입니다. 따라서 이 프로토콜은 안구 은행(25)에서 쉽게 사용할 수 있는 FF-OCM 이미지로부터 각질세포 밀도를 측정하는 정확하고 신뢰할 수 있는 방법을 포함하며 공초점 현미경의 관례를 따릅니다. FF-OCM을 이용하여, 각질세포 밀도는 또한 단면도(33)에서 직접 각질세포를 계수함으로써 결정될 수 있으며, 이는 다수의 en 면 슬라이스 상에서 각질세포를 계수해야 하는 공초점 현미경에 비해 잠재적인 이점이다. 그러나, 각질세포 밀도가 정상 대조군 34,35,36,37에서보다 질환 환자에서 더 낮고 질환 중 증도(34,38)와 상관관계가 있는 것으로 입증된 살아있는 환자와 달리, 이는 인간 생체외 조직 샘플(25)에서는 그렇지 않았다 , 이식 후 좋은 시력 회복을 위해 기증자 각막에 최소한의 각질 세포가 필요한지 여부를 결정하기 위해서는 추가 연구가 필요합니다. 병리학적 조직에서와 같이 기증자 조직의 낮은 각질세포 밀도는 노화, 허혈에 의해 유도된 세포의 사후 손실 및/또는 기증자 조직의 저장으로 설명될 수 있습니다 27,39,40,41. 또한 이 프로토콜에서 획득하고 이미지화한 정상적인 기증자 각막은 저장되고 부종성이거나 부종이 제거되었거나 EU 안구 은행 협회의 표준에 따라 내피 품질이 좋지 않아 이식 전에 안구 은행에 의해 폐기되었다는 점도 지적해야 합니다. 설명된 프로토콜과 함께 FF-OCM 이미징이 안구 은행 설정에 포함된다면 각막은 일반적으로 여기에서 가능한 것보다 더 신선한 상태로 평가될 것이며, 이는 각질세포 밀도에 영향을 미칠 수 있습니다.
기질 품질 분석을 위해 여기에 설명된 프로토콜은 Descemet의 멤브레인 평가를 위해 확장될 수 있으며, 이는 두께 및 구조 측면에서 FF-OCM으로도 해결할 수 있습니다(21,24). 이것은 얇은 Descemet의 막이 간질에서 분리하기가 더 어려울 수 있는 Descemet의 막 내피 각막 성형술을 위한 조직 선택에 유용할 수 있습니다.
결론적으로, FF-OCM은 보관 중 인간 기증자 각막 기질의 정확하고 신뢰할 수 있는 평가를 가능하게 합니다. 이식편의 품질을 개선함으로써 현재 안구 은행 절차에 이 프로토콜을 추가하면 기증자 조직의 선별 및 선택과 각막 성형술의 결과를 개선할 수 있는 잠재력이 있습니다. FF-OCM 장치를 안구 은행 루틴에 실제로 통합하는 것은 맞춤형 CMOS 카메라의 개발로 인한 더 빠른 이미지 획득 및 더 넓은 시야, 이미징 중 각막 보관 및 취급을 위한 맞춤형 멸균 일회용 카세트 설계를 포함한 최근 기술 업데이트를 통해 촉진되어야 합니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작업은 PRTS(Projet de Recherche Translationelle en Santé) 보조금 No ANR-13-PRTS-0009(VB)에 따라 ANR(Agence Nationale de Recherche)과 Marie Skłodowska-Curie 보조금 계약 No 709104(K.I.)에 따라 유럽 연합의 Horizon 2020 연구 및 혁신 프로그램으로부터 자금을 받았습니다. 저자는 세포 계수 및 조직 학적 처리에 도움을 준 Céline de Sousa에게 감사를 표합니다.
Light-CT Scanner | LLTech, France | http://www.lltechimaging.com/products-applications/products/ | FF-OCM device used in this manuscript for imaging |
CorneaJet | EuroBio, France | http://www.eurobio-cornea.com/en/corneamax-10-100-ml-xml-352-822.html | Organ culture medium in which donor corneas are stored |
CorneaMax | EuroBio, France | http://www.eurobio-cornea.com/en/corneajet-10-50-ml-xml-352-823.html | Dextran-supplemented organ culture medium used for deturgescence |
Fiji (ImageJ) | National Institute of Health, Bethesda, MD, USA | https://fiji.sc/ | Open source image processing software |
Matlab | Mathworks, Inc., Natick, MA, USA | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | Mathematical computing software |