Este artigo descreve um protocolo para eficientemente derivar e cultura linhas de células-tronco pluripotentes de embriões de rato no estágio de blastocisto.
Derivação de células-tronco embrionárias (mESC) do mouse é o processo pelo qual pluripotentes linhagens celulares estabelecidas dos embriões pré-implantação. Estas linhas mantêm a capacidade de renovar o Self ou diferenciar sob condições específicas. Devido a essas propriedades, o mESC são uma ferramenta útil na medicina regenerativa, modelagem de doença e estudos de engenharia de tecidos. Este artigo descreve um protocolo simples para obter linhas de mESC com eficiências de alta derivação (60-80%) pelo cultivo de blastocistos de estirpes de rato permissiva em células alimentador definido suplementado com fator inibitório de leucemia. O protocolo também pode ser aplicado derive eficientemente mESC linhas de cepas não-permissiva do mouse, pela simples adição de um coquetel de dois inibidores da pequeno-molécula ao meio de derivação (2i médio). Os procedimentos detalhados sobre a preparação e a cultura de células de alimentador, coleta e cultura de embriões de rato e derivação e cultura das linhas mESC são fornecidos. Este protocolo não requer equipamento especializado e pode ser realizado em qualquer laboratório com conhecimentos de cultura de pilha mamífera básica.
Células-tronco embrionárias (ESC) são pluripotentes células derivadas de embriões pré-implantação, que mantêm a capacidade de renovar o Self ou diferenciar sob condições específicas1. Baseado sobre essas propriedades, ESC tornaram-se uma ferramenta útil para a medicina regenerativa, modelagem de doença e de estudos engenharia de tecido2.
ESC foram derivados pela primeira vez embriões pré-implantação do mouse, originando linhas ESC (mESC) rato com sucesso baixa3,4. Durante anos, a eficiência de derivação permaneceu baixa devido à dificuldade de manutenção da pluripotência em vitro. Além disso, a presença de alimentador células5, que melhoram a eficiência de derivação, promover a fixação da colônia e realçar estabilidade espectofotômetro6, várias modificações das protocolo conduzir a uma melhoria na manutenção da pluripotência. As mais importantes foram a adição de fator inibitório de leucemia (LIF) mESC meio de cultura7,8, a utilização de embriões da 129S2 fundo permissiva9 e a cultura dos mESC com suplementado com definido soro, livre de potenciais fatores de diferenciação10. Mais recentemente, evidências convincentes tem mostrado que a adição de um coquetel de dois moduladores da pequeno-molécula de vias de sinalização para o meio de cultura de mESC (conhecido como 2i) é melhor manter a pluripotência. O cocktail de 2i consiste numa combinação de inibidor MEK PD0325901, que reduz os sinais de diferenciação por inibição da via de quinase (MAPK) proteína mitogen-ativado, e o inibidor de GSK3β CHIR99021, que aumenta a sobrevivência da pilha de baixa densidade Ativando o Wnt caminho11.
No presente artigo, descrevemos um protocolo simples derive eficientemente mESC linhas de blastocistos de rato. Seguimos os procedimentos padrão, cultivo de embriões de estirpes permissivas em células alimentador suplementado de derivação com LIF e uma substituição de soro12. Seguir este protocolo, mESC linhas pode ser derivada com eficiências equivalentes às obtidas no meio de 2i. Apesar disso, 2i pode ser adicionado para evitar possíveis problemas com manutenção de pluripotência, ou quando se trabalha com cepas não-permissiva.
Embora a derivação de linha mESC é um procedimento bem conhecido rotineiramente utilizado em muitos laboratórios, sua eficiência não é sempre tão alta quanto o esperado devido os múltiplos fatores que podem perturbar a manutenção da pluripotência. No presente artigo mostramos, passo a passo, como estabelecer linhas de mESC com alta eficiência usando um protocolo simples e confiável. Estas eficiências são semelhantes aos relatados na literatura.
Para garantir a máxima eficiênc…
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos Jonatan Lucas pela sua assistência técnica com a cultura de pilha do alimentador, serviço Estabulari de la UAB para cuidados com animais e Domènec Martín para gravar o vídeo. Este trabalho foi apoiado pelo Ministerio de Economia y AGL2014 competitividade-52408-R e a Generalitat de Catalunya 2014 SGR-524. MVC é beneficiário de uma bolsa de PIF-UAB.
1 mL sryringe | BD | 309628 | |
2-β-mercaptoethanol | Life Technologies | 31350-010 | |
4-well plate | Thermo Scientific Nunc | 176740 | |
Acidic Tyrode's solution | Home-made | See recipe in Nagy et al, 2003. For short-term storage (up to 1 month) keep it at 4ºC. Alternatively, for long-term storage keep it at -20ºC. If the efficiency of the solution diminishes, it should be acidified by the adition of a small drop of HCl 1M. | |
BSA | Sigma | A3311 | |
Chicken anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 488 | Molecular Probes – Invitrogen | A-21200 | 1:500 dilution. Secondary antibody for Oct4, Tuj1, αSMA and AFP mouse antibodies. |
CHIR990212 | Axon Medchem | 1386 | Reconstitute with 2.15 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20ºC. Avoid freeze and thaw cycles. |
CryoTube | Thermo Scientific Nunc | 3754518 | |
DMSO | Sigma | 41640 | |
DMEM | BioWest | L0107 | |
FBS | BioWest | S1810 | Inactivate it prior to use by heating for 30 mins at 56ºC. Aliquot and store at -20ºC |
Flushing needle | BD | 304000 | Cut the end of the needle and ground to a blunt tip on an abrasive stone |
Gelatin from porcine skin | Fluka | 48724 | Dilute at 0,2% in destilled water and autoclave it. Each dilution can be used for a month. |
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 594 | Molecular Probes – Invitrogen | A-11037 | 1:500 dilution. Secondary antibody for Sox2 rabbit antibody. |
HBSS | BioWest | L0611 | |
Hepes-buffered CZB | Home-made | See composition in Chatot et al, 1989 | |
Human chorionic gonadotropin | Divasa-Farmavic | Veterin-Corion 3000 UI | Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20ºC for up to two months. Once thawed do not freeze again. |
Human foreskin fibroblasts | ATCC | ATCCSCRC-1041 | For long term storage it is recommended to store them in liquid nitrogen. |
KnockOut Serum Replacement | Life Technologies | 10828-028 | Photosensitive. It is recommended to aliquot it in small volumes such as 10 ml and store it at -20ºC (check the expiration date). Avoid freeze and thaw cycles. |
KSOMaag Evolve | Zenith Biotech | ZEKS-050 | Supplement with 4 mg/ml BSA. Equilibrate at 37ºC and 5% CO2 a day prior to use. |
Leukemia Inhibitory Factor | Merk Millipore | ESG1106 | |
Mice | Charles River/Harlan | It is recommended to use mice from a permissive strain in terms of mESC derivation (such as 129S2 or C57BL). However, inbreed strains are less efficient producing embryos. Therefore, it is recomended to use a hybrid strain, such as 129S2 x C57BL or B6CBAF1 to take advantage of the hybrid vigor. | |
Mineral oil | Sigma | M8410 | Embryo tested. Photosensitive. |
Mitomycin C | Serva | 2980501 | Reconstitute the powder with MilliQ water at 0.5 mg/ml. Store at 4ºC protected from light. Attention, it is harmful and suspected of causing cancer. |
Mouse anti-tubulin β III (Tuj1) | Biolegend | MMS-435P | 1:500 dilution |
Mouse monoclonal anti-αSMA | Sigma | A5228 | 1:200 dilution |
Mouse monoclonal anti-AFP | R&D Systems | MAB1368 | 1:50 dilution |
Mouse monoclonal anti Oct3/4 | Santa cruz | Sc-5279 | 1:50 dilution |
Non-Essential Amino Acids | Life Technologies | 11140-035 | |
PD0325901 | Axon Medchem | 1408 | Reconstitute with 2.08 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20ºC. Avoid freeze and thaw cycles. |
Petri dish (35mm) | Thermo Scientific Nunc | 153066 | |
Petri dish (60mm) | Thermo Scientific Nunc | 150288 | |
Pregnant mare's serum gonadotropin | Foligon | Foligon-1000 UI | Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20ºC for up to two months. Once thawed do not freeze again. |
Rabbit policlonal anti-Sox2 | Merck Millipore | AB5603 | 1:200 dilution |
T75 falcon | Thermo Scientific | 130190 | |
Trypsin-EDTA 10x | BioWest | X0930 | Dilute 1:10 in HBSS to obtain a 1x solution |