Cet article décrit un protocole pour efficacement dérivent et la culture de lignées de cellules souches pluripotentes embryonnaires de souris au stade de blastocyste.
Souris des cellules souches embryonnaires (mESC) dérivation est le processus par lequel pluripotentes lignées cellulaires sont établies d’embryons préimplantatoires. Ces lignes conservent la capacité à se renouveler ou faire la différence dans des conditions spécifiques. En raison de ces propriétés, mESC constituent un outil utile en médecine régénérative, modélisation de la maladie et études d’ingénierie tissulaire. Cet article décrit un protocole simple pour obtenir des lignes de mESC avec des rendements élevés de dérivation (60-80 %) en cultivant des blastocystes de souches de souris permissive sur cellules nourricières en milieu défini additionné du facteur inhibiteur de leucémie. Le protocole peut également être appliqué pour calculer efficacement mESC lignes de souches de souris non permissif, par le simple ajout d’un cocktail de deux inhibiteurs de petites molécules au milieu de dérivation (2i moyen). Des procédures détaillées sur la préparation et de la culture de cellules nourricières, collection et la culture des embryons de souris et la dérivation et la culture de mESC lignes sont fournies. Ce protocole ne nécessite pas de matériel spécialisé et peut être effectué dans n’importe quel laboratoire connaissant bien la culture des cellules de mammifères base.
Cellules souches embryonnaires (CSE) sont des cellules pluripotentes provenant d’embryons préimplantatoires, qui conservent la capacité à se renouveler ou différencier sous conditions particulières1. Basé sur ces propriétés, les ESC sont devenus un outil utile pour la médecine régénérative, modélisation de maladies et tissus ingénierie études2.
ESC pour la première fois provenaient des embryons de souris préimplantatoire, originaires des lignées de souris ESC (mESC) avec faible succès3,4. Pendant des années, l’efficacité de la dérivation est restée faible en raison de la difficulté de maintenir la pluripotence in vitro. En outre la présence d’alimentation cellules5, qui améliorent l’efficacité de la dérivation, promouvoir l’attachement de la colonie et d’améliorer la stabilité caryotypique6, plusieurs modifications du protocole plomb à une amélioration de l’entretien de la pluripotence. Les plus importants sont l’ajout de la facteur inhibiteur leucémie (LIF) mESC milieu de culture7,8, l’utilisation d’embryons du contexte permissif de 129S29 et la culture de mESC avec additionné défini sérum, libre de potentiel de facteurs de différenciation10. Plus récemment, des preuves convaincantes ont montré que l’ajout d’un cocktail de deux petites molécules modulateurs des voies de signalisation au milieu de culture mESC (appelé 2i) est préférable de maintenir la pluripotence. Le cocktail de 2i se compose d’une combinaison de l’inhibiteur MEK PD0325901, ce qui réduit les signaux de différenciation en inhibant la voie de la kinase (MAPK) protéine mitogène-, et l’inhibiteur de la GSK3β CHIR99021, ce qui améliore la survie des cellules à faible densité en activant la voie de signalisation Wnt11.
Dans le présent article, nous décrivons un protocole simple pour calculer efficacement mESC lignes des blastocystes de souris. Nous suivons des procédures standards, mise en culture des embryons provenant des souches permissives sur cellules nourricières dans dérivation additionné FRV et d’un sérum remplacement12. Suite à ce protocole, les lignes de la mescaline peut être dérivée avec des rendements équivalents à ceux obtenus dans un milieu 2i. Malgré cela, 2i peut être ajoutée pour éviter d’éventuels problèmes avec pluripotence maintenance ou lorsque vous travaillez avec des souches non permissif.
Bien que la dérivation de ligne mESC est une procédure connue couramment utilisée dans de nombreux laboratoires, son efficacité n’est pas toujours plus élevée que prévu en raison des multiples facteurs qui peuvent perturber la pluripotence entretien. Dans le présent article, nous montrons, étape par étape, comment faire pour établir des lignes de mESC avec des rendements élevés à l’aide d’un protocole simple et fiable. Ces gains d’efficacité sont similaires à ceux rapportés dans la littérature.<…
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions Jonatan Lucas pour son assistance technique pour la culture de cellules d’engraissement, Servei Estabulari de la UAB pour soins aux animaux et Domènec Martín pour l’enregistrement de la vidéo. Ce travail a été soutenu par le Ministerio de Economia y Competitividad AGL2014-52408-R et la Generalitat de Catalunya 2014 SGR-524. MVC est bénéficiaire d’une bourse de recherche de partenaires d’envol-UAB.
1 mL sryringe | BD | 309628 | |
2-β-mercaptoethanol | Life Technologies | 31350-010 | |
4-well plate | Thermo Scientific Nunc | 176740 | |
Acidic Tyrode's solution | Home-made | See recipe in Nagy et al, 2003. For short-term storage (up to 1 month) keep it at 4ºC. Alternatively, for long-term storage keep it at -20ºC. If the efficiency of the solution diminishes, it should be acidified by the adition of a small drop of HCl 1M. | |
BSA | Sigma | A3311 | |
Chicken anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 488 | Molecular Probes – Invitrogen | A-21200 | 1:500 dilution. Secondary antibody for Oct4, Tuj1, αSMA and AFP mouse antibodies. |
CHIR990212 | Axon Medchem | 1386 | Reconstitute with 2.15 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20ºC. Avoid freeze and thaw cycles. |
CryoTube | Thermo Scientific Nunc | 3754518 | |
DMSO | Sigma | 41640 | |
DMEM | BioWest | L0107 | |
FBS | BioWest | S1810 | Inactivate it prior to use by heating for 30 mins at 56ºC. Aliquot and store at -20ºC |
Flushing needle | BD | 304000 | Cut the end of the needle and ground to a blunt tip on an abrasive stone |
Gelatin from porcine skin | Fluka | 48724 | Dilute at 0,2% in destilled water and autoclave it. Each dilution can be used for a month. |
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 594 | Molecular Probes – Invitrogen | A-11037 | 1:500 dilution. Secondary antibody for Sox2 rabbit antibody. |
HBSS | BioWest | L0611 | |
Hepes-buffered CZB | Home-made | See composition in Chatot et al, 1989 | |
Human chorionic gonadotropin | Divasa-Farmavic | Veterin-Corion 3000 UI | Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20ºC for up to two months. Once thawed do not freeze again. |
Human foreskin fibroblasts | ATCC | ATCCSCRC-1041 | For long term storage it is recommended to store them in liquid nitrogen. |
KnockOut Serum Replacement | Life Technologies | 10828-028 | Photosensitive. It is recommended to aliquot it in small volumes such as 10 ml and store it at -20ºC (check the expiration date). Avoid freeze and thaw cycles. |
KSOMaag Evolve | Zenith Biotech | ZEKS-050 | Supplement with 4 mg/ml BSA. Equilibrate at 37ºC and 5% CO2 a day prior to use. |
Leukemia Inhibitory Factor | Merk Millipore | ESG1106 | |
Mice | Charles River/Harlan | It is recommended to use mice from a permissive strain in terms of mESC derivation (such as 129S2 or C57BL). However, inbreed strains are less efficient producing embryos. Therefore, it is recomended to use a hybrid strain, such as 129S2 x C57BL or B6CBAF1 to take advantage of the hybrid vigor. | |
Mineral oil | Sigma | M8410 | Embryo tested. Photosensitive. |
Mitomycin C | Serva | 2980501 | Reconstitute the powder with MilliQ water at 0.5 mg/ml. Store at 4ºC protected from light. Attention, it is harmful and suspected of causing cancer. |
Mouse anti-tubulin β III (Tuj1) | Biolegend | MMS-435P | 1:500 dilution |
Mouse monoclonal anti-αSMA | Sigma | A5228 | 1:200 dilution |
Mouse monoclonal anti-AFP | R&D Systems | MAB1368 | 1:50 dilution |
Mouse monoclonal anti Oct3/4 | Santa cruz | Sc-5279 | 1:50 dilution |
Non-Essential Amino Acids | Life Technologies | 11140-035 | |
PD0325901 | Axon Medchem | 1408 | Reconstitute with 2.08 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20ºC. Avoid freeze and thaw cycles. |
Petri dish (35mm) | Thermo Scientific Nunc | 153066 | |
Petri dish (60mm) | Thermo Scientific Nunc | 150288 | |
Pregnant mare's serum gonadotropin | Foligon | Foligon-1000 UI | Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20ºC for up to two months. Once thawed do not freeze again. |
Rabbit policlonal anti-Sox2 | Merck Millipore | AB5603 | 1:200 dilution |
T75 falcon | Thermo Scientific | 130190 | |
Trypsin-EDTA 10x | BioWest | X0930 | Dilute 1:10 in HBSS to obtain a 1x solution |