Este protocolo descreve um método simples para análise de sinais de cálcio em plantas geradas pela alimentação hemipteran insetos, como pulgões. Arabidopsis thaliana transformada com o biosensor de cálcio GFP GCaMP3 permitem a imagem em tempo real na vivo da dinâmica de cálcio com alta resolução temporal e espacial.
Íons cálcio estão previstos para ser entidades de sinalização chaves durante interações bióticas, com sinalização de cálcio formando uma parte estabelecida da resposta de defesa a planta elicitores microbianas e ferimento causado por mastigar insetos, suscitando cálcio sistêmico sinais nas plantas. No entanto, o papel do cálcio na vivo durante o estresse biótico é ainda incerto. Este protocolo descreve o uso de um sensor de cálcio geneticamente codificado para detectar sinais de cálcio nas plantas durante a alimentação por uma praga hemipteran. Hemipterans tais como afídios perfuram um pequeno número de células com especializado, alongada chupando bucais, tornando-os a ferramenta ideal para estudar a dinâmica de cálcio quando uma planta é confrontada com um estresse biótico, que é distinto de uma resposta ferindo. Além disso, biosensores fluorescentes estão revolucionando a medição de sinalização moléculas na vivo em animais e plantas. Expressar um biossensor baseado em GFP cálcio, GCaMP3, na planta modelo Arabidopsis thaliana permite para o tratamento de imagens em tempo real da dinâmica de cálcio planta durante a alimentação, com uma alta resolução espacial e temporal de insetos. Um ensaio repetível e robusto foi desenvolvido utilizando a microscopia de fluorescência de desanexado folhas de GCaMP3, que permite a medição contínua da dinâmica de cálcio citosólico antes, durante e após a alimentação do inseto. Isto revela uma elevação de cálcio rápida altamente-localizada em torno do afídio alimentação local que ocorre em poucos minutos. O protocolo pode ser adaptado a outros estresses bióticos, tais como espécies de insetos adicionais, enquanto o uso de Arabidopsis thaliana permite a rápida geração de mutantes para facilitar a análise molecular do fenômeno.
Cálcio (Ca2 +) é um dos elementos mais onipresentes sinalização em plantas. Um aumento transitório da concentração de Ca2 + citosólico ([Ca2 +]cyt) é decodificado por uma complexa rede de componentes downstream e está envolvido na resposta para ambos os estresses bióticos e abióticos1,2. Um aumento de [Ca2 +]cyt é uma das primeiras respostas de elicitores microbianas, formando uma parte comum da planta defesa resposta3,4,5. Também foram observados aumentos [Ca2 +]cyt em resposta ao ferimento causado por mastigar insetos, tais como lepidópteros6,7. No entanto, o papel potencial da planta Ca2 + sinais em resposta a ameaças bióticas que causar danos ao apenas algumas células de viver não tem sido explorado. O verde pêssego pulgão Myzus persicae é um inseto hemipteran que representa uma ameaça significativa para o mundo da agricultura8,9, e Ca2 + o efluxo de espaço extracelular tem sido observado em folhas infestadas com M. persicae10. Esta descreve protocolo um método robusto e repetível de medição planta Ca2 + sinais enquanto M. persicae alimentar das folhas usando um fluorescente biosensor de Ca2 + , com pulgões e GCaMP3 oferta de novas ferramentas com as quais disse o papel de Ca2 + durante as interações bióticas.
CA2 +-seletivos microeletrodos anteriormente foram usados para medir [Ca2 +] em plantas11,12. Mais recentemente, abordagens bioluminescentes e fluorescentes tem-se padronizado. Estes biosensores vincular Ca2 + e emitem luz, permitindo a un-paralelizadas oportunidades para estudar a dinâmica de Ca2 + em células e tecidos. Biossensores de CA2 + podem ser injetados como corantes ou estàvel produzidas mediante a introdução do biosensor sequência no genoma do organismo através de transformação (ou seja, geneticamente codificado biosensores) de código. O último oferece grandes vantagens de ser facilmente expressa em tecido vivo e capaz de Localização subcellular13. A proteína aequorin, isolada de Aequorea victoria (água-viva) foi o primeiro geneticamente codificado Ca2 + biosensor implantado em plantas14. Como uma proteína bioluminescente, aequorin não requer excitação pela luz externa, o que evita o cromóforo branqueamento e autofluorescência15. Aequorin tem sido usada com sucesso para medir fluxos [Ca2 +] em resposta a vários estímulos, incluindo temperatura16, patógenos17,18,19, sal stress20 ,21e ferindo7. No entanto, isso é desfavorecido pela intensidade sinal relativamente baixo, tornando a detecção de fluxos [Ca2 +] em células individuais e de tecidos com sensor pobre expressão difícil13.
O desenvolvimento de Ca2 + biossensores que pode fluorescem tem complementado aequorin permitindo para análise detalhada subcellular e tecidos-nível da dinâmica de Ca2 + . Dentre os biosensores fluorescentes mais comuns são a transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET)-com base em Cameleons. FRET Cameleons são compostos de duas proteínas, normalmente PCP e YFP, que são trazidos no contato próximo pela mudança conformacional induzida pela ligação de Ca2 + para um domínio de calmodulina na região de vinculador YFP-PCP. Este contacto permite a transferência de energia de PCP para YFP, e a mudança resultante na fluorescência destes fluorophores permite a quantificação exata de [Ca2 +] através do cálculo do rácio dos sinais de fluorescência dos dois Fluorophores22. FRET Cameleons são superiores aos corantes fluorescentes aequorin e não-ratiometric, como eles são que menos afetados pelo nível de expressão da proteína23 e muitas vezes têm um maior rendimento fluorescente, permitindo a imagem celular e subcellular23. Por exemplo, FRET Cameleons tem sido recentemente utilizados para identificar o Ca2 + sinais de longa distância em plantas e para resolver estas para o celular nível24,25,26.
Uma descoberta recente com fluorescente GFP-baseado Ca2 + biosensores tem sido o desenvolvimento de biossensores single-fluoróforo altamente sensível (single-FP). Single-FP biosensores consistem em uma única circular permutated GFP associada a calmodulina e peptídeo M13, Ca2 + vinculando a calmodulina, resultando em uma reação mediada por água entre calmodulina e GFP tão quanto protonate GFP e aumento 28,de27,rendimento fluorescente29. Single-FP sensores oferecem várias vantagens sobre o traste Cameleons, incluindo o desenho experimental mais simples e uma potencialmente maior resolução temporal de imagens,30. Embora single-FP sensores não podem quantificar absoluto [Ca2 +] como simplesmente como sensores FRET, eles são superiores, para a análise da dinâmica espacial e temporal de Ca2 + sinais5,23. GCaMPs um do melhor single-FP sensores28 e que foram objecto de várias revisões para melhorar seu rendimento fluorescente, gama dinâmica, afinidade de Ca2 + e sinal-ruído rácios31,32 , 33 , 34. o GCaMPs foram usados com sucesso em sistemas de animais, tais como zebrafish neurônios motores35 e fruta voa junções neuromusculares34. Mutagénese aleatória de GCaMP3 resultou em classes adicionais de single-FP sensores, incluindo o ultra-sensível GCaMP636 e o GECOs29. Os GECOs recentemente foram usados em Arabidopsis thaliana (doravante referido como Arabidopsis) para medir fluxos de Ca2 + em resposta a ATP, quitina e o flg22 de elicitor bacteriana. Este estudo também demonstrou que a biosensor R-GECO superou o traste Cameleon YC3.6 em termos de sinal máxima mudança e sinal-ruído relação5.
Devido à facilidade de uso, fluorescente de alto rendimento e alta resolução temporal que pode ser conseguida com GCaMP biosensores, GCaMP3 foi geneticamente codificado em Arabidopsis sob promotor do vírus do mosaico da couve-flor 35S. As ferramentas de genéticas disponíveis para a investigação de Arabidopsis permitem a análise molecular detalhada de Ca2 + sinais medidos por GCaMP3. Além disso, o biosensor de GCaMP3 pode ser visualizado sob um microscópio de fluorescência, ao invés de um sistema mais caro e confocal. Este protocolo permite todo-tecido de imagem, essencial quando conduzindo experimentos com estresses bióticos ao vivo. O experimento é projetado tais que desanexados folhas de plantas de 35S::GCaMP3 estão flutuando na água, para evitar a fuga de insetos e para restringir a alimentação de um tecido específico. O método descrito neste artigo, portanto, permite a análise de folha dinâmica de Ca2 + durante a alimentação por M. persicae, resultando na caracterização de uma planta nova sinalização resposta. Esse método também pode ser adaptado para trabalhar com outros estresses bióticos, como outras espécies de insetos e patógenos microbianos e com outros tecidos vegetais, tais como raízes.
O método descrito neste artigo permite a análise em tempo real da planta Ca2 + sinalização durante um estresse biótico tais como alimentação de insetos. Ele demonstra que uma das respostas a primeira planta de tais ameaças é uma localizadas [Ca2 +]cyt elevação ao redor do local de alimentação do inseto. Através da utilização de mutantes, esse método permitirá a caracterização molecular e fisiológica de tais sinais, que não era possível anteriormente. Um passo crítico no presente protocolo é garantir que as folhas isoladas não são excessivamente perturbadas durante o processo de desprendimento (passo 3.2) ou ao transferir os insetos para as folhas (etapa 4.5). Dado que o protocolo atual fornece uma medida relativa da [Ca2 +]cyt ao invés de uma concentração absoluta, é vital que as configurações do microscópio são mantidas constantes durante todo o experimento. Há também o potencial para viés humano durante a seleção de ROIs e a análise dos dados, e como tal, é recomendável que os experimentos são realizados duplo-cego.
Existem várias vantagens significativas de medição [Ca2 +]cyt durante estresse biótico com este protocolo. Primeiro, o uso de um fluoróforo único com um alto rendimento fluorescente permite a imagem a ser realizado em um estereomicroscópio, que é menos caro do que usar um microscópio confocal. O uso de um único fluoróforo também faz análise e coleta de dados simples, como não há apenas uma medição para gravar. Além disso, o uso de um microscópio estereoscópico permite a geração de imagens de folhas inteiras, que é essencial, dado que muitas interações bióticas, incluindo interações planta-pulgão, ocorrem em grande escala espacial. A alta resolução temporal da imagem captura possível com GCaMP3, baseado na dissociação rápida de Ca2 + do sensor após ligação23,30 e o fluorescente de alto rendimento, permite para as medidas a serem tomadas até cada 5 s. Além disso, o ensaio de folha evita a fuga do inseto, uma chave limitando o passo para a realização de tais experiências sobre plantas inteiro (em preparação). As folhas destacadas também assegurar que o inseto se alimenta de um local pré-definido, permitindo a análise da dinâmica de Ca2 + antes, durante e após a alimentação. Este protocolo também garante que folhas de estádios de desenvolvimento semelhantes são utilizadas para análise.
A principal desvantagem deste protocolo origina-se o uso de um biossensor não-ratiometric. Com single-FP biosensores, variação na emissão de GFP pode resultar de variáveis experimentais que não [Ca2 +]cyt, tais como mudanças no pH celular, movimento ou o nível de expressão do biosensor. Estas questões não forem encontradas com FRET Cameleons durante o traste, como a transferência de energia do PCP para YFP só ocorre após a ligação de Ca2 + . Outras condições que alteram as propriedades fluorescentes do fluorophores individuais são improváveis imitar as mudanças opostas na intensidade de PCP e YFP, e o cálculo de ratiometric usado inerentemente normaliza as medições para muitos destes outros artefatos ópticos23,,30. Isto faz estimativas de absoluta [Ca2 +]cyt mais confiável com FRET Cameleons. Consequentemente, GCaMP3 é melhor usado como um biossensor para medir o relativo [Ca2 +]cyt, embora seja ainda suficiente para detectar e caracterizar fenômenos biológicos em plantas5,(in preparation). Portanto, é essencial usar controles para mostrar que o efeito observado é devido a Ca2 +, incluindo Ca2 +-relacionado mutantes genéticos(em preparação) ou farmacológica Ca2 + canal inibidores como La3 + . Importante, single-FP biosensores normalmente exibem um maior rendimento fluorescente e maior alcance dinâmico (ou seja, um aumento em florescimento mediante vinculação de Ca2 + ) que FRET Cameleons23, que faz GCaMP mais adequado para imagem de nível de tecido, enquanto FRET Cameleons são uma ferramenta útil para a imagem latente de celular com um microscópio confocal5,25.
Durante a execução do presente protocolo, é possível que alguns problemas que exigem solução de problemas surgirão. Por exemplo, é recomendável que as amostras em que os visores de folha de controle (não tratado) grande [Ca2 +]cyt elevações são descartados (etapa 6.3). Esses transientes são provavelmente o resultado de stress induzido pela microscopia. Com efeito, a luz azul é conhecido eliciar Ca2 + sinais38,39,40,41, e a luz de alta intensidade pode também resultar em temperatura e stress osmóticos, ambos os quais também eliciar [Ca2 +]cyt elevações21,25,42. Consequentemente, para reduzir tais tensões, é importante realizar o experimento em um quarto bem ventilado e com temperatura controlada e evitar desnecessariamente longos tempos de exposição. Também é importante para não perturbar as folhas excessivamente durante o destacamento ou durante a microscopia para evitar toque-suscitou [Ca2 +]cyt elevações43,44,45. Problemas também podem ser encontrados com resolução de insetos. Com M. persicae, os insetos não se estabelecem nas folhas em várias amostras. Isso pode ser um resultado de defesa de ferida-suscitou a moradia folhas46,47, ou a perturbação dos insetos pela luz azul. Na verdade, visão de M. persicae é regido por três fotorreceptores, incluindo um com uma sensibilidade de pico de 490 nm48. Redução da exposição de microscopia e manipulando os pulgões com cuidado podem reduzir a aflição e incentivar a resolução.
O protocolo descrito no jornal atual dá novas perspectivas para a compreensão molecular das interações inseto-planta e a resposta da planta ao estresse biótico. Permite a visualização de uma das respostas a primeira planta para alimentação de insetos e facilita ainda mais as investigações através da utilização de Arabidopsis genéticas recursos disponíveis. Além disso, este protocolo permite a utilização de organismos vivos, ao contrário de extratos49 ou elicitores50. No futuro, esta técnica poderia ser aplicada a outros estresses bióticos, como outras espécies de insetos, nematoides ou patógenos microbianos, bem como a estresses abióticos. A microscopia de GCaMP3 também pode ser modificada para outros tecidos vegetais, ROIs alternativos na folha, ou mesmo toda plantas de imagem. Além disso, existe o potencial para o biosensor ser genéticaly codificado em espécies de plantas adicionais. Por conseguinte, o protocolo descrito neste documento tem o potencial de disfarçado a base molecular de Ca2 + sinalização em uma gama de interações bióticas romance entre plantas e outras espécies.
The authors have nothing to disclose.
Gostaríamos de agradecer a Grant Calder (John Innes Centre, U.K.) para o Conselho a respeito de microscopia. Os autores também desejam agradecer a John Innes Centre hortícola e departamentos de Entomologia por sua assistência. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa de estudo de doutoramento de John Innes Foundation (TV), conceder B/JJ004561/1 do BBSRC e o John Innes Foundation (T.V., M.A., J.C., S.M., S.H., T.M. e D.S.), um ano na colocação da indústria do John Innes Centre (M.A.) , uma bolsa de estudo de Verão da sociedade de bioquímica do UK (J.C.), JST PRESTO (M.T.) e subvenções MCB 1329723 e 1557899-IOS da Fundação Nacional de ciência (M.T. e S.G.).
35S::GCaMP3 Arabidopsis | John Innes Centre/Universty of Wisconsin | – | Step 1.1 |
100 mm2 square plastic plates | R & L Slaughter Ltd, Upminster, UK | For growing GCaMP plants (Step 1.1) | |
¼ strength Murashige and Skoog (MS) medium | homemade: 1.1 g Murashige and Skoog medium, 7.5 g sucrose, 10 g Formedium agar, 1 L de-ionised water | – | For growing GCaMP plants (Step 1.1) |
Col-0 Arabidopsis | – | – | For growing aged aphid colony (Step 2.1) |
Myzus persicae(Sulzer) | clone US1L, Mark Stevens, Brooms Barn | – | Orginally from Rothamsted Research, UK (Step 2.1) |
Artist's paintbrush size 2 | Hobbycraft | 610101 | To tranfer aphids (Steps 2.1, 2.4 and 4.6) |
96-well MicrotitreTM plate | ThermoFisher Scientific | 2101 | To contain the detached GCaMP3 leaves (Step 3.2) |
Aluminium foil | Wrap Film Systems, Telford, UK | 26B06 | To cover plates with floating leaves overnight (Step 3.3) |
Clear plastic wrap | SC Johnson & Son, Racine, WI, USA | To cover plates with floating leaves overnight, and to cover leaves during microscopy (Steps 3.3 and 4.7) | |
M205FA stereo microscope | Leica Microsystems | – | For GFP imaging (Step 4.1) |
Leica Application Suite v3.2.0 | Leica Microsystems | Microscope software (Step 4.1) | |
Fiji (Image J) v1.48a | National Institutes of Health, USA) | – | For image analysis (Step 6.1) |