Este trabalho descreve um protocolo para a imunoprecipitação de cromatina (ChIP) usando uma linha de células T de mouse maduras. Este protocolo é adequado para investigar a distribuição de marcas de histonas específicas em locais promotores específicos ou em todo o genoma.
As vias de sinalização regulam os programas de expressão gênica através da modulação da estrutura da cromatina em diferentes níveis, tais como modificações pós-tradução (PTMs) das caudas de histonas, troca de histonas canônicas com variantes de histonas e despejo de nucleossomos. Essa regulamentação requer a ligação de fatores de transcrição sensíveis ao sinal (TFs) que recrutam enzimas modificadoras de cromatina em elementos reguladores definidos como potenciadores. Entender como as cascatas de sinalização regulam a atividade do intensificador requer uma análise abrangente da ligação de TFs, enzimas modificadoras de cromatina e a ocupação de marcas de histonas específicas e variantes de histonas. Os ensaios de imunoprecipitação com cromatina (ChIP) utilizam anticorpos altamente específicos para imunoprecipitar complexos específicos de proteína / ADN. A análise subsequente do DNA purificado permite a identificação da região ocupada pela proteína reconhecida pelo anticorpo. Este trabalho descreve um protocolo de forma eficiente paraRIP Chift de proteínas de histonas em uma linha de células T de mouse maduras. O protocolo apresentado permite o desempenho de ensaios ChIP em um prazo razoável e com alta reprodutibilidade.
O desenvolvimento, a diferenciação e a homeostasia dependem de programas específicos de expressão gênica que são estabelecidos por eventos de sinalização que modulam a estrutura da cromatina e, portanto, determinam se um gene específico é ativado ou reprimido de uma maneira específica de célula e tempo. Durante o desenvolvimento das células T, programas específicos de expressão gênica devem ser estabelecidos para determinar adequadamente a maturação dos precursores de células T do duplo negativo (DN) para o estado único positivo (SP), passando por vários estádios intermediários 1 . Como o programa de expressão gênica é regulado dinamicamente durante o desenvolvimento das células T foi amplamente investigado em anos anteriores por vários laboratórios 2 , 3 , 4 , 5 , 6 .
Por modificações pós-tradução (PTMs) de histonas, a troca deHistonas canônicas com variantes de histonas, despejo de nucleossomos e metilação de DNA regulam o interruptor de genes ON / OFF. Vários grupos investigaram a distribuição genômica de PTMs e variantes de histonas para determinar marcas associadas a diferentes estados de cromatina nas regiões reguladoras proximal e distal 7 , 8 , 9 , 10 . As cascatas de sinalização orquestram a regulação dinâmica da cromatina através da troca de enzimas modificadoras de cromatina positivas e negativas (também conhecidas como modificadores de cromatina) em elementos potenciadores específicos. Esses modificadores de cromatina regulam a estrutura da cromatina e, portanto, a saída da transcrição, por exemplo, metilação histona e acetilação dinâmica. Este é o caso na via de sinalização Notch 11 , 12 , 13 ,14.
PTM de histonas dinâmicas; Trocas com variantes de histonas; E a ocupação dinâmica de histonas, fatores de transcrição e cofatores podem ser investigadas por ensaios de imunoprecipitação com cromatina (ChIP). Anticorpos altamente específicos são usados para purificar complexos de DNA-proteína específicos, e o DNA purificado é analisado por PCR quantitativa (qPCR); Sequenciação profunda (ChIP-Seq); Ou, com menor freqüência hoje em dia, hibridação ao microarray (ChIP-ChIP).
Os ensaios ChIP são às vezes desafiadores devido a complicações com a lise das células, corte da cromatina e / ou baixa especificidade dos anticorpos. Várias estratégias foram adotadas para melhorar o protocolo, como é o caso do NEXSON 15 . O uso de sonicadores de banho de água de refrigeração evita o aquecimento da amostra que pode danificar os epítopos presentes na proteína sob investigação, mas a energia necessária para o corte das amostras é dispersa na água.Outra melhoria foi feita com o desenvolvimento de dispositivos de ultra-sonografia focados que impedem a dispersão da energia. Portanto, os dispositivos ultra-sônicos focados permitem melhorias na lise celular e no cisalhamento da cromatina, eliminando as variações induzidas pelo operador e aumentando significativamente a reprodutibilidade.
Este trabalho descreve um protocolo (visão geral esquemática na Figura 1 ) para executar eficientemente o ChIP de proteínas histonas em uma linha de células T de mouse maduras chamada E2-10HA 16 , 17 . As células T são geralmente difíceis de lição, e o corte de sua cromatina revelou-se ineficiente. Neste protocolo, que faz uso de um ultra-som focado em resfriamento, o número de células, o buffer de lise e a configuração de cisalhamento foram otimizados para a linha de células T de mouse E2-10HA. Este protocolo permite executar um ChIP com alta reprodutibilidade e em um tempo razoável. Na verdade, ele exigeÉ aproximadamente dois dias para cortar a cromatina e para avaliar a qualidade do corte e três dias para realizar a imunoprecipitação, reverter a reticulação e purificar o DNA.
ChIP é uma técnica válida para investigar se as proteínas ou os seus PTMs são enriquecidos em regiões genômicas específicas. Os resultados do ensaio ChIP são muitas vezes difíceis de interpretar por razões biológicas ou técnicas. As razões biológicas são múltiplas e incluem ligação fraca ou indireta de proteínas ao DNA. Há também limitações técnicas, tais como especificidade limitada de anticorpos e lise celular ineficiente ou corte de cromatina. Um guia de solução de problemas ( Tabela 5 ) pode ajudar o leitor a resolver os problemas que podem ser encontrados com os ensaios ChIP.
Este protocolo, que faz uso de um dispositivo de ultra-sonografia focado em resfriamento, permite cortar eficientemente a cromatina de uma linha de células T de mouse maduras. O principal passo crítico do protocolo é representado pelo corte da cromatina, que sempre deve ser otimizado para cada tipo de célula. Sugere-se que varie o número de células e o número de ciclos de sonicação. Além disso, ela A eficiência de aring é influenciada negativamente pela presença de precipitados SDS nas amostras, que podem se formar durante a lise das células em gelo com tampão de lise SDS. Neste caso, é melhor incubar a amostra após a lise à temperatura ambiente por alguns minutos para reduzir a presença de precipitados SDS. Recomenda-se otimizar o protocolo para obter fragmentos cortados entre 200 e 500 pb e avaliar sempre a qualidade de cisalhamento das amostras antes de prosseguir com a imunoprecipitação. Além disso, o tempo de fixação, quantidade de anticorpo e / ou células, e as condições de lavagem devem ser otimizadas para cada anticorpo.
Mais um passo crítico na elaboração de um procedimento ChIP é a escolha do anticorpo, uma vez que os anticorpos de baixa especificidade reduzem significativamente a eficiência da imunoprecipitação. Anteriormente, um procedimento de teste de qualidade unificado permitiu a avaliação da especificidade de vários anticorpos disponíveis no mercado Ss = "xref"> 19. O pipeline de triagem foi baseado em ponto blot, Western blot e ChIP, fornecendo uma lista de reagentes de alta qualidade adequados para ChIP 19 . Mais recentemente, a especificidade de vários anticorpos comercialmente disponíveis foi avaliada usando plataformas de microarrays de péptidos de histona de alta densidade, permitindo o estabelecimento de um banco de dados sobre especificidade de anticorpos 20 . O leitor pode usar essa ferramenta útil para identificar os anticorpos mais específicos que podem ser usados para experiências de ChIP.
Este protocolo não foi testado para células T primárias e, neste caso, o leitor deve consultar outros protocolos publicados que executam com sucesso o ChIP nas células T primárias 3 , 4 , 21 . Notavelmente, este protocolo foi usado com sucesso para executar ChIP em uma linhagem de células T de progenitor de mouse, bem como em uma linha de células endoteliais de mouse.
Ove_content "> 5 x 10 6 células devem ser usadas para cada imunoprecipitação para a análise de marcas de histonas. Como este protocolo também pode ser adequado, com alguma otimização, para executar ChIP em TFs ou cofactores, é melhor aumentar o número de células Usado para a imunoprecipitação nesses casos. Para alcançar o número necessário de células para cada experiência, mais alíquotas de lisado cortado podem ser reunidas antes de diluir a cromatina no tampão de diluição.Este protocolo também pode ser modificado para realizar ChIP em proteínas endógenas que não se ligam diretamente ao DNA. Neste caso, a pré-fixação com reticulantes proteína-proteína ( por exemplo, adipimidato de dimetilo, DMA) pode ser necessária (ver Apêndice B para mais informações). O desempenho bem sucedido de ChIP em cofactores foi feito anteriormente por sobreexpressão de proteínas que são fundidas em uma etiqueta de biotina. Neste caso, a proteína foi purificada com estreptavidina-conjugaEsferas magnéticas e magnéticas e uma pré-fixação com DMA foi realizada 22 .
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a P. Käse e T. Schmidt-Wöll pela excelente assistência técnica. Este trabalho foi apoiado pela bolsa de pesquisa colaborativa TRR81 e o programa Heisenberg (BO 1639 / 5-1) da DFG (Fundação Alemã de Pesquisa), a Sociedade Max Planck e o EXC 294 em Freiburg e o Cluster de Excelência para o Sistema Cardio Pulmonar (ECCPS) em Giessen para TB
Agilent High Sensitivity D5000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5593 | |
Agilent High Sensitivity D5000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5592 | |
Agilent Tapestation 4200 | Agilent Technologies | G2991AA | |
Covaris S220 AFA System | Covaris | 500217 | |
dimethyl adipimidate (DMA) | Thermo Fisher Scientific | 20660 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Pan-Biotech | 1502-P121301 | |
Formaldehyde (FMA) | Sigma-Aldrich | F8775 | |
Insulin solution human | Sigma-Aldrich | I9278-5ML | |
Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM) | Gibco | 21980-032 | |
Minimum essential medium non-essential amino acids (MEM NEAA) | Gibco | 11140-035 | |
nProtein A Sepharose 4 Fast Flow | GE Healthcare | 17-5280-02 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
Peptone primatone | Sigma-Aldrich | P4963-100G | |
Phase Lock Gel Heavy 2 ml | 5 Prime | 2302830 | |
Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1) | Roth | A156.2 | |
Phosphate-buffered saline (PBS) | GIBCO | 14190-094 | |
Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade | Thermo Fisher Scientific | 25530049 | |
QIAquick PCR Purification Kit (250) | Qiagen | 28106 | |
Qubit 3.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
Qubit assay tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | |
RNase A, DNase and protease-free (10 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | EN0531 | |
Tube AFA Fiber & Cap | Covaris | 520081 |