この研究は、成熟マウスT細胞株を用いたクロマチン免疫沈降(ChIP)のためのプロトコールを記載している。このプロトコルは、特定のプロモーター部位またはゲノムワイドにおける特定のヒストンマークの分布を調べるのに適しています。
シグナル伝達経路は、ヒストン尾部の翻訳後修飾(PTM)、ヒストン変異体との標準的ヒストンの交換、およびヌクレオソーム退化など、異なるレベルでのクロマチン構造の調節を介して遺伝子発現プログラムを調節する。そのような調節は、エンハンサーとして規定された調節エレメントでクロマチン修飾酵素を補充するシグナル感受性転写因子(TF)の結合を必要とする。シグナリングカスケードがエンハンサー活性を調節する方法を理解するには、TF、クロマチン修飾酵素の結合、および特定のヒストンマークとヒストン変異体の占有の包括的な分析が必要です。クロマチン免疫沈降(ChIP)アッセイは、特異的タンパク質/ DNA複合体を免疫沈降させるために高度に特異的な抗体を利用する。精製DNAのその後の分析は、抗体によって認識されるタンパク質が占める領域を同定することを可能にする。この作業では、効率的にperform成熟マウスT細胞株におけるヒストンタンパク質のChIP。提示されたプロトコールは、妥当な時間枠内で高い再現性でChIPアッセイの実施を可能にする。
発達、分化およびホメオスタシスは、クロマチン構造を調節し、したがって特定の遺伝子が細胞および時間特異的に活性化されるか、または抑制されるかを決定するシグナル伝達事象によって確立される特定の遺伝子発現プログラムに依存する。 T細胞発達中に、いくつかの中間段階1を経て、二重陰性(DN)から単一陽性(SP)状態へのT細胞前駆体の成熟を適切に決定するために、特定の遺伝子発現プログラムを確立しなければならない。遺伝子発現プログラムがT細胞発達中にどのように動的に調節されるかは、過去数年にいくつかの研究室によって幅広く研究されてきた2、3、4、5、6。
ヒストンの翻訳後修飾(PTM)により、ヒストン変異体を有する標準的なヒストン、ヌクレオソーム退縮、およびDNAメチル化は、遺伝子のON / OFFスイッチを調節する。いくつかのグループが、PTMおよびヒストン変異体のゲノムワイド分布を調査して、近位および遠位の調節領域7,8,9,10の異なるクロマチン状態に関連する痕跡を決定した。シグナリングカスケードは、特定のエンハンサー要素での陽性および陰性のクロマチン修飾酵素(クロマチン修飾因子としても知られている)の交換を介して、動的クロマチン制御を調整する。これらのクロマチン修飾因子は、例えばダイナミックヒストンのメチル化およびアセチル化によるクロマチン構造および従って転写産物を調節する。これは、Notchシグナル伝達経路11,12,13 、14。
動的ヒストンPTM;ヒストン変異体との交換;ヒストン、転写因子、および補因子の動的占有率は、クロマチン免疫沈降(ChIP)アッセイによって調べることができる。高度に特異的な抗体を用いて特定のDNA-タンパク質複合体を精製し、精製されたDNAを定量PCR(qPCR)によって分析する。ディープシーケンシング(ChIP-Seq);今日では、マイクロアレイへのハイブリダイゼーション(ChIP-ChIP)の頻度は低い。
ChIPアッセイは、細胞の溶解、クロマチンの剪断および/または抗体の低特異性による合併症のために時々困難である。 NEXSON 15の場合のように、プロトコルを改善するためのいくつかの戦略が採用されています。冷却水浴ソニケーターの使用は、調査中のタンパク質上に存在するエピトープに損傷を与える試料加熱を回避するが、試料のせん断に必要なエネルギーは水中に分散する。エネルギーの分散を防止する集束超音波装置の開発により、別の改良がなされた。したがって、集束超音波装置は、細胞溶解およびクロマチン剪断の改善を可能にし、オペレーター誘発変異を排除し、再現性を有意に増加させる。
この研究は、E2-10HA 16,17と呼ばれる成熟マウスT細胞系においてヒストンタンパク質のChIPを効率的に行うためのプロトコール( 図1の概略図 )を説明している。 T細胞は通常溶解するのが困難であり、そのクロマチンのせん断は非効率的であることが明らかにされている。冷却された集束超音波装置を使用するこのプロトコールでは、細胞数、溶解緩衝液、およびせん断設定が、E2-10HAマウスT細胞株について最適化された。このプロトコルは、高い再現性と妥当な時間でChIPを実行することを可能にする。実際には、それはrequirクロマチンを剪断して剪断の質を評価するおよそ2日間、免疫沈降を行い、架橋を逆転させ、DNAを精製するために3日間。
ChIPは、タンパク質またはそのPTMが特定のゲノム領域で富化されているかどうかを調べる有効な技術である。 ChIPアッセイの結果は、生物学的または技術的理由により解釈するのが困難なことが多い。生物学的理由は多種多様であり、タンパク質のDNAへの弱いまたは間接的な結合を含む。限られた抗体特異性および非効率的な細胞溶解またはクロマチン剪断などの技術的限界もある。トラブルシューティングガイド( 表5 )は、ChIPアッセイで遭遇する可能性のある問題を解決するのに役立ちます。
このプロトコルは、冷却された集束超音波装置を利用して、成熟マウスT細胞株のクロマチンを効率的に剪断することを可能にする。プロトコルの主な重要なステップは、各細胞タイプに対して常に最適化されなければならないクロマチンのせん断によって表される。細胞の数および超音波処理サイクルの数を変えることが示唆されている。さらに、彼女は効率は、SDS溶解バッファーを用いて氷上で細胞を溶解する間に形成される試料中のSDS沈殿物の存在によって悪影響を受ける。この場合、SDS沈殿物の存在を減少させるために、室温で数分間、溶解後に試料をインキュベートすることが最善である。 200〜500 bpのせん断断片を得るためにプロトコールを最適化し、免疫沈降を続ける前に試料のせん断品質を常に評価することが推奨される。さらに、固定時間、抗体および/または細胞の量、および洗浄条件は、各抗体について最適化されなければならない。
低特異性抗体が免疫沈降の効率を著しく低下させるので、ChIP手順を成功させるためのもう1つの重要なステップは、抗体の選択である。以前は、統一された品質試験手順により、市販されているいくつかの抗体の特異性を評価することができました ss = "xref"> 19。スクリーニングパイプラインは、ドットブロット、ウエスタンブロット、およびChIPに基づいており、ChIP 19に適した高品質の試薬のリストを提供しています。より最近、いくつかの市販の抗体の特異性を、高密度ヒストンペプチドマイクロアレイプラットフォームを用いて評価し、抗体特異性に関するデータベースの確立を可能にした20 。読者は、この有用なツールを用いて、ChIP実験に使用できる最も特異的な抗体を同定することができる。
このプロトコールは一次T細胞については試験されておらず、この場合、読者は一次T細胞上でChIPを首尾よく行う他の公表されたプロトコール3,4,21を参照すべきである。特に、このプロトコルは、マウス前駆細胞T細胞系およびマウス内皮細胞系でChIPを行うのに首尾よく使用されている。
このプロトコールは、いくつかの最適化を伴って、TFまたは補因子についてChIPを実施するのにも適しているので、細胞の数を増やすことが最も好ましい各実験に必要な細胞数に達するために、剪断された溶解物のより多くのアリコートを、希釈緩衝液中でクロマチンを希釈する前に一緒にプールすることができる。このプロトコールは、DNAに直接結合しない内在性タンパク質に対してChIPを行うように改変することもできる。この場合、タンパク質 – タンパク質架橋剤( 例えば、ジメチルアジピミデート、DMA)による前固定が必要となり得る(詳細については付録Bを参照)。補因子に対するChIPの成功した性能は、以前にビオチンタグに融合したタンパク質を過剰発現させることによって行われていた。この場合、タンパク質をストレプトアビジンコンジュゲート磁気ビーズを塗布し、DMAによる前固定を行った22 。
The authors have nothing to disclose.
優れた技術支援をしてくださったP.Käse氏とT. Schmidt-Wöll氏に感謝します。この研究は、DFG(ドイツ研究財団)、フライブルクのマックスプランク学会とEXC 294の共同研究助成金TRR81とハイゼンベルグプログラム(BO 1639 / 5-1)と、心肺システムのエクセレンスクラスターGiessenからTBまで
Agilent High Sensitivity D5000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5593 | |
Agilent High Sensitivity D5000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5592 | |
Agilent Tapestation 4200 | Agilent Technologies | G2991AA | |
Covaris S220 AFA System | Covaris | 500217 | |
dimethyl adipimidate (DMA) | Thermo Fisher Scientific | 20660 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Pan-Biotech | 1502-P121301 | |
Formaldehyde (FMA) | Sigma-Aldrich | F8775 | |
Insulin solution human | Sigma-Aldrich | I9278-5ML | |
Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM) | Gibco | 21980-032 | |
Minimum essential medium non-essential amino acids (MEM NEAA) | Gibco | 11140-035 | |
nProtein A Sepharose 4 Fast Flow | GE Healthcare | 17-5280-02 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
Peptone primatone | Sigma-Aldrich | P4963-100G | |
Phase Lock Gel Heavy 2 ml | 5 Prime | 2302830 | |
Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1) | Roth | A156.2 | |
Phosphate-buffered saline (PBS) | GIBCO | 14190-094 | |
Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade | Thermo Fisher Scientific | 25530049 | |
QIAquick PCR Purification Kit (250) | Qiagen | 28106 | |
Qubit 3.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
Qubit assay tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | |
RNase A, DNase and protease-free (10 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | EN0531 | |
Tube AFA Fiber & Cap | Covaris | 520081 |