概要

Deterjan çözünmez Protein toplamları--dan insan öldükten sonra beyin zenginleştirme

Published: October 24, 2017
doi:

概要

Deterjan çözünmez protein toplamları–dan insan öldükten sonra beyin zenginleştirme için bir kısaltılmış Ayırma Protokolü tanımlanır.

Abstract

Bu çalışmada, deterjan çözünmez protein toplamları–dan insan öldükten sonra beyin zenginleştirme için bir kısaltılmış tek adım Ayırma Protokolü açıklar. İyonik deterjan N-loril-sarcosine (sarkosyl) etkin bir şekilde beyin dokusu gibi deterjan çözünmez protein toplamları nörodejeneratif proteinopathies, geniş bir dizi zenginleştirme sağlayan yerel olarak katlanmış proteinlerin solubilizes Alzheimer hastalığı (Ah), Parkinson hastalığı ve amyotrofik lateral skleroz ve prion hastalıkları. İnsan kontrolü ve reklam ölüm sonrası beyin dokuları ultrasantrifüj patolojik fosforile tau, neurofibrillary temel bileşenidir dahil olmak üzere deterjan çözünmez protein toplamları zenginleştirmek için sarkosyl huzurunda tarafından homojenize ve posalı düğüm reklam. Western Blot toplanan fosforile tau ve deterjan çözünür protein, erken Endosome antijen 1 (EEA1) kontrolü ve reklam beyin farklı çözünürlük gösterdi. Proteomik çözümleme Ayrıca βzenginlik ortaya-amiloid (Aβ), tau, snRNP70 (U1 – 70 K) ve apolipoprotein E (APOE) bu kontrol, önceki doku ayırma stratejileri ile tutarlı göre reklam beyin sarkosyl çözünmez kesirler . Böylece, bu basit zenginleştirme Protokolü deneysel uygulamalar Western Blot ve fonksiyonel proteini ortak toplama deneyleri kütle spektrometresi tabanlı proteomik kadar geniş bir yelpazede için idealdir.

Introduction

Nörodejeneratif hastalıklar Alzheimer hastalığı (Ah), Parkinson hastalığı (PD), Huntington hastalığı (HD), amyotrofik lateral skleroz (ALS) ve yakından ilgili prion hastalıkları gibi yavaş yavaş birikimi ile karakterize proteinopathies vardır deterjan çözünmez protein toplamları ile bilişsel birlikte beyin reddedin. 1 , 2 bu paylaşılan patolojik özellik etyoloji ve bu nörodejeneratif hastalıklar Patofizyoloji merkezi bir rol oynadığı düşünülmektedir. 2 bu toplamları liflerinin misfolded protein βsergilenmesi birim yinelenen oluşan polimer amiloid, genellikle-yapısı. 1 , 2 , 3 , 4 biyokimyasal olarak, amiloid toplamları kimyasal veya termal denatürasyon ve solubilization, onların arıtma, analiz için benzersiz zorluklar sunar3 son derece dayanıklıdır ve geleneksel biyokimyasal teknikleri ile çalışma. 2 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 şaşırtıcı olmayan bir şekilde, deterjan çözünmez protein fraksiyonu nörodejeneratif hastalıklar misfolded proteinleri birikimi ile ilgili Patofizyoloji içine çok araştırma odağı olmuştur. 6 , 12 , 13 , 14

Biyokimyasal ayırma teknikleri kez ölüm sonrası beyin homogenates dan deterjan çözünmez kesir zenginleştirmek için kullanılmıştır. 6 , 12 , 13 , 14 en yaygın yöntemlerden birini doku homogenates ile tampon sıralı çıkarma ve sıkılık çözünür ve çözünmez kesirler bölme ultrasantrifüj tarafından takip, artan deterjanlar içerir. Yaygın olarak kullanılan sıralı Ayırma Protokolü6,14 donmuş doku örnekleri bir deterjan-Alerjik düşük tuz (LS) arabelleği homojenizasyon içerir ve sonuç çözünmez granül sonra sırayla ile ayıklanır yüksek tuz, non-iyonik deterjanlar, yüksek Sükroz içeren arabellekleri, üre iyonik deterjanlar ve nihayet chaotropes gibi. 6 , 14 önemli ölçüde zaman ve emek taahhüt bunları tamamlamak için gereken böyle bir sıralı ayırma iletişim kuralları belli bir dezavantajı var. Homojenizasyon ve ultrasantrifüj de dahil olmak üzere, tipik beş adım Ayırma Protokolü saat veya bile birkaç alabilir gün tamamlamak için. 4 , 6 , 7 , 10 , 15 , 16 , 17 , 18 Ayrıca, çok sayıda patolojik protein toplamları kalır en sert koşullar19,20 hariç hepsi çözünmez oluşturulan kesirler çoğu sınırlı değeri. Böylece, yüksek tuz konsantrasyonları ve non-iyonik deterjanlar kullanarak daha az sıkı ayırma adımları büyük ölçüde gereksizdir.

Önceki çalışmalarda iyonik deterjan N-loril-sarcosine (sarkosyl) basitleştirilmiş tek adım deterjan Ayırma Protokolü için mükemmel bir aday olduğunu göstermiştir. 5 , 6 , 12 , 13 , 14 , 21 , 22 , 23 denaturing bir deterjan olarak sarkosyl beta-amiloid (Aβ),6,11 oluşan misfolded protein toplamları çözücü olmadan yerel olarak katlanmış proteinlerin beyinde büyük çoğunluğu solubilize için sıkı fosforile tau (pTau),6 TAR DNA’ya bağlanıcı protein 43 (TDP-43),14 Alfa-synuclein,12,13 büyük,23 veya U1 küçük nükleer ribonucleoproteins (U1 snRNPs) gibi U1 – 70 K. 5 , 21 , 22 Sarkosyl her yerde Anyonik deterjan Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) daha az sıkı olduğu için daha az sağlam oligomeric formları SDS tedavi dayanıklı olamaz misfolded protein toplamları korur. 9

Daha önce biz sonuçları daha zahmetli sıralı ayırma yöntemleri için karşılaştırılabilir elde kısaltılmış bir deterjan-Ayırma Protokolü nitelendirdi. 5 daha az sıkı ayırma adımları ihmal olarak, deterjan çözünmez protein toplamları üzerinden öldükten sonra insan beyni zenginleştirme için facile tek adım Ayırma Protokolü geliştirmeye başardık. 5 burada açıklanan bu ayrıntılı iletişim kuralı deneysel uygulamalar Western Blot arasında değişen geniş bir yelpazesi için son derece uygundur ve kütle spektrometresi tabanlı proteomik fonksiyonel proteini misfolding ve tohum toplama deneyleri. 5 , 6 , 21

Protocol

etik beyanı: tüm beyin dokuları Emory Alzheimer elde edilmiştir ' s hastalığı Araştırma Merkezi (ADRC) beyin banka. İnsan öldükten sonra dokular uygun kurumsal inceleme Kurulu (IRB) protokolleri altında elde. 1. homojenizasyon ve ayırma doku seçim Not: ölüm sonrası frontal korteks doku sağlıklı kontrol (Ctl) ve patolojik olarak dondurulmuş teyit edilen reklam durumlarda Emory seçildi ADRC beyin banka (n = 2). Alzheimer içi…

Representative Results

Deterjan çözünmez protein toplamları kontrol ve AD ölüm sonrası beyin (şekil 1) zenginleştirmek için kullanılan kısaltılmış tek adım sarkosyl-ayırma protokol. Proteinler üzerinden TH-S, S1, S2 ve P2 kesirler SDS-sayfa, 15 dk Coomassie nazik Coomassie parlak mavi G-250 boyama arabellek ile boyama tarafından mavi sabitleştirici arabellek takip için sabit tarafından çözüldü. Protein S2 kesir tespit edilemez seviyede olduğundan resuspen…

Discussion

Burada biz tanıtmak ve kütle spektrometresi tabanlı proteomik analizinden deneyleri misfolding fonksiyonel proteini değişen deneysel uygulamalar çok çeşitli için geçerlidir kısaltılmış bir tek adım deterjan-Ayırma Protokolü tartışmak ve western Blot. 5 , 6 , 7 , 10 Bu metodoloji olduğunu Belki de çoğu zaman nörodejeneratif proteinopathies Alzheimer gibi çalışmak için …

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Drs. Jim Lah ve Allan Levey, Emory sevgi Nöroloji, yazarlar yararlı yorumlar ve öneriler için teşekkür ederiz. Bu eser kısmen finanse edildi hızlanan tıp ortaklık tarafından (U01AG046161-02), Emory Alzheimer’ın hastalığı Araştırma Merkezi (P50AG025688) ve yaşlanma Ulusal Enstitüsü (R01AG053960-01) N.T.S. için erişim izni verme Bu araştırma da kısmen Emory nörolojik NINDS çekirdek İmkanları grant, P30NS055077 nevropatoloji çekirdeği tarafından desteklenmiştir.

Materials

Protease and phosphatase inhibitor cocktail, EDTA-free (100X) Thermo Fisher 78441 protease & phosphatase inhibitor cocktail
Sonic Dismembrator System (ultrasonicator) Fisher Scientific FB505110 microtip ultrasonicator
Optimax TLX Ultracentrifuge Beckman Coulter 361545 refrigerated ultracentrifuge
TLA120.1 rotor Beckman Coulter 362224 ultracentrifuge rotor
500 ul (8x34mm) polycarbonate tubes, thickwall Beckman Coulter 343776 ultracentrifuge tubes for TLA120.1 rotor
4X SDS sample buffer Home-made N/A SDS-PAGE
TCEP solution, neutral pH Thermo Fisher 77720 reducing agent
(TBS) blocking buffer Thermo Fisher 37542 blocking buffer
(TBS) blocking buffer + 0.05% Tween 20 Thermo Fisher 37543 blocking buffer and antibody diluent
4-12% Bolt Bis-Tris Plus gels, 10-well Thermo Fisher NW04120BOX precast SDS-PAGE gels
MES SDS Running Buffer (20X) Thermo Fisher B0002 SDS-PAGE running buffer
N-Lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl) Sigma Aldrich L5777-50G detergent
1.5 ml polypropylene Pellet Pestle Kimble Chase 749521-1500 homogenization tool
cordless motor for Pellet Pestle Kimble Chase 749540-0000 homogenization tool
Anti-Tau-2 (pan tau) antibody Chemicon MAB375 antibodies
Anti-phospho-threonine 231 Tau antibody Millipore MAB5450 antibodies
Anti-phospho-seroine 202 and threonine 205 Tau antibody (AT8) Thermo Fisher MN1020 antibodies
Anti-early endosome antigen 1 (EEA1) antibody abcam ab2900 antibodies
Alexa Fluor 680 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody Thermo Fisher A21058 antibodies
Alexa Fluor 790 donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody Thermo Fisher A11374 antibodies
iBlot2 Dry Blotting System Thermo Fisher IB21001 Gel transfer
iBlot2 Transfer Stacks, Nitrocellulose, mini Thermo Fisher IB23002 Gel transfer

参考文献

  1. Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. Toxic Proteins in Neurodegenerative Disease. Science. 296 (5575), 1991 (1991).
  2. Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature Medicine. 10, S10-S17 (2004).
  3. Ramírez-Alvarado, M., Merkel, J. S., Regan, L. A systematic exploration of the influence of the protein stability on amyloid fibril formation in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (16), 8979-8984 (2000).
  4. Hamley, I. W. The Amyloid Beta Peptide: A Chemist’s Perspective. Role in Alzheimer’s and Fibrillization. Chem Rev. 112 (10), 5147-5192 (2012).
  5. Diner, I., et al. Aggregation Properties of the Small Nuclear Ribonucleoprotein U1-70K in Alzheimer Disease. J. Biol. Chem. 289 (51), 35296-35313 (2014).
  6. Gozal, Y. M., et al. Proteomics Analysis Reveals Novel Components in the Detergent-Insoluble Subproteome in Alzheimer’s Disease. J. Proteome Res. 8 (11), 5069-5079 (2009).
  7. Hales, C. M., et al. Changes in the detergent-insoluble brain proteome linked to amyloid and tau in Alzheimer’s Disease progression. PROTEOMICS. , (2016).
  8. Julien, C., Bretteville, A., Planel, E., Sigurdsson, E. M., Calero, M., Gasset, M. . Amyloid Proteins: Methods and Protocols. , 473-491 (2012).
  9. Nizhnikov, A. A., et al. Proteomic Screening for Amyloid Proteins. PLoS ONE. 9 (12), e116003 (2014).
  10. Seyfried, N. T., et al. Quantitative analysis of the detergent-insoluble brain proteome in frontotemporal lobar degeneration using SILAC internal standards. J. Proteome Res. 11 (5), 2721-2738 (2012).
  11. Woltjer, R. L., et al. Proteomic determination of widespread detergent insolubility, including Aβ but not tau, early in the pathogenesis of Alzheimer’s disease. FASEB J. , (2005).
  12. Miake, H., Mizusawa, H., Iwatsubo, T., Hasegawa, M. Biochemical Characterization of the Core Structure of α-Synuclein Filaments. J. Biol. Chem. 277 (21), 19213-19219 (2002).
  13. Hasegawa, M., et al. Phosphorylated α-Synuclein Is Ubiquitinated in α-Synucleinopathy Lesions. J. Biol. Chem. 277 (50), 49071-49076 (2002).
  14. Neumann, M., et al. Ubiquitinated TDP-43 in Frontotemporal Lobar Degeneration and Amyotrophic Lateral Sclerosis. Science. 314 (5796), 130 (2006).
  15. Bishof, I., Diner, I., Seyfried, N. An Intrinsically Disordered Low Complexity Domain is Required for U1-70K Self-association. FASEB J. 29 (Suppl 1), (2015).
  16. Braak, H., Braak, E. Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathol. 82 (4), 239-259 (1991).
  17. Noguchi, A., et al. Isolation and Characterization of Patient-derived, Toxic, High Mass Amyloid β-Protein (Aβ) Assembly from Alzheimer Disease Brains. J. Biol. Chem. 284 (47), 32895-32905 (2009).
  18. Bai, B., et al. U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer’s disease. Proc. Natl. Acad. Sci. 110 (41), 16562-16567 (2013).
  19. Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. Alzheimer’s β-Amyloid Protein Is Covalently Modified when Dissolved in Formic Acid. J Neurochem. 54 (6), 2050-2056 (1990).
  20. Yang, L. -. S., Gordon-Krajcer, W., Ksiezak-Reding, H. Tau Released from Paired Helical Filaments with Formic Acid or Guanidine Is Susceptible to Calpain-Mediated Proteolysis. J Neurochem. 69 (4), 1548-1558 (1997).
  21. Bai, B., et al. U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer’s disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16562-16567 (2013).
  22. Hales, C. M., et al. U1 small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs) aggregate in Alzheimer’s disease due to autosomal dominant genetic mutations and trisomy 21. Mol Neurodegener. 9 (1), 15 (2014).
  23. Xiong, L. -. W., Raymond, L. D., Hayes, S. F., Raymond, G. J., Caughey, B. Conformational change, aggregation and fibril formation induced by detergent treatments of cellular prion protein. J Neurochem. 79 (3), 669-678 (2001).
  24. Mirra, S. S., et al. The Consortium to Establish a Registry for Alzheimer’s Disease (CERAD). Part II. Standardization of the neuropathologic assessment of Alzheimer’s disease. Neurology. 41 (4), 479-486 (1991).
  25. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
  26. Guo, J. L., et al. Unique pathological tau conformers from Alzheimer’s brains transmit tau pathology in nontransgenic mice. J. Exp. Med. 213 (12), 2635-2654 (2016).
  27. Matveev, S. V., et al. A distinct subfraction of Aβ is responsible for the high-affinity Pittsburgh compound B-binding site in Alzheimer’s disease brain. J Neurochem. 131 (3), 356-368 (2014).

Play Video

記事を引用
Diner, I., Nguyen, T., Seyfried, N. T. Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain. J. Vis. Exp. (128), e55835, doi:10.3791/55835 (2017).

View Video