概要

Enriquecimento de agregados da proteína insolúvel em detergente do cérebro humano após a morte

Published: October 24, 2017
doi:

概要

Um protocolo de fracionamento abreviado para o enriquecimento dos agregados de proteína insolúvel em detergente do cérebro humano após a morte é descrito.

Abstract

Neste estudo, descrevemos um protocolo abreviado fracionamento de etapa única para o enriquecimento dos agregados de proteína insolúvel em detergente do cérebro humano após a morte. O detergente iônico N-Lauril-sarcosina (sarkosyl) efetivamente solubiliza proteínas dobradas nativamente no tecido cerebral, permitindo o enriquecimento de agregados da proteína insolúvel em detergente de uma ampla gama de proteinopathies neurodegenerativas, tais como A doença de Alzheimer (AD), doença de Parkinson e esclerose lateral amiotrófica e doenças de príon. Controle humano e tecidos do cérebro após a morte de AD foram homogeneizadas e sedimentada por ultracentrifugação na presença de sarkosyl para enriquecer agregados de proteína insolúvel em detergente incluindo tau fosforilada patológica, o componente do núcleo do tangles emaranhados em AD. Mancha ocidental demonstrou a solubilidade diferencial de agregados-tau fosforilada e a proteína solúvel em detergente, Early Endosome antígeno 1 (EEA1) no controle e no cérebro do AD. Análise proteômica também revelou o enriquecimento de β-amiloide (Aβ), tau, snRNP70 (U1 – 70 K) e apolipoproteína E (APOE) nas fracções sarkosyl insolúveis do cérebro AD comparados de controle, consistente com estratégias de fracionamento de tecido anterior . Assim, o presente protocolo simples enriquecimento é ideal para uma ampla gama de aplicações experimentais variando de mancha ocidental e proteína funcional ensaios de agregação co a espectrometria de massa-baseado proteomics.

Introduction

Doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer (AD), a doença de Parkinson (PD), a doença de Huntington (HD), esclerose lateral amiotrófica (ela) e as doenças de príon estreitamente relacionadas são proteinopathies caracterizadas pelo acúmulo gradual de agregados de proteína insolúvel em detergente no cérebro com acompanhamento cognitivo declinam. 1 , 2 este recurso compartilhado patológico é pensado para jogar um papel central na etiologia e fisiopatologia dessas doenças neurodegenerativas. 2 estes agregados, normalmente, compostos de fibras de amiloides poliméricas, que são compostas de repetir unidades de misfolded proteínas exibindo Cruz β-estrutura. 1 , 2 , 3 , 4 bioquimicamente, agregados amiloides são altamente resistentes à desnaturação química ou térmica e solubilização,3 que apresenta desafios únicos para a sua purificação, análise e estudo através de técnicas bioquímicas tradicionais. 2 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 não é novidade, a fração de proteína insolúvel em detergente tem sido o foco de muita pesquisa em fisiopatologia das doenças neurodegenerativas que envolvem o acúmulo de misfolded proteínas. 6 , 12 , 13 , 14

Técnicas de fracionamento bioquímico frequentemente têm sido utilizadas para enriquecer a fração insolúvel em detergente de homogenates cerebral post-mortem. 6 , 12 , 13 , 14 um dos métodos mais comuns envolve a extração sequencial de tecido homogenates com buffers e detergentes de aumentar o rigor, seguido por ultracentrifugação para particionar as frações solúveis e insolúveis. Um protocolo comumente usado fracionamento sequencial6,14 envolve a homogeneização de amostras de tecido congelado em um buffer de detergente livre baixo sal (LS) e as pelotas insolúveis resultantes então são extraídas sequencialmente com amortecedores que contêm sal elevado, detergentes não-iônicos, alta sacarose, detergentes iônicos e finalmente chaotropes como ureia. 6 , 14 uma desvantagem óbvia de tais protocolos um fracionamento sequencial é o tempo substancial e compromisso de trabalho necessário para concluí-las. Incluindo a homogeneização e ultracentrifugação, um protocolo típico de cinco etapas de fracionamento pode levar várias horas ou mesmo dias para completar. 4 , 6 , 7 , 10 , 15 , 16 , 17 , 18 além disso, como muitos agregados de proteína patológica permanecem insolúveis em todos, mas as mais adversas condições19,20 a maioria das frações geradas são de valor limitado. Assim, as etapas de fracionamento menos rígidas utilizando altas concentrações de sal e detergentes não-iônicos são em grande parte redundantes.

Estudos anteriores mostraram que o detergente iônico N-Lauril-sarcosina (sarkosyl) é um excelente candidato para um protocolo simplificado fracionamento de detergente de etapa única. 5 , 6 , 12 , 13 , 14 , 21 , 22 , 23 como um detergente de desnaturação, sarkosyl é suficientemente rigorosa para solubilizar a maioria vasta das proteínas nativamente dobradas no cérebro sem solubilizing agregados de misfolded proteínas compostos por beta-amiloide (Aβ),6,11 tau fosforilada (pTau),6 TAR ADN-proteína obrigatória 43 (TDP-43),14 alfa-synuclein,12,13 do tremor epizoótico,23 ou U1 pequenas ribonucleoproteínas nucleares (snRNPs U1) como U1 – 70 K. 5 , 21 , 22 Como sarkosyl é menos rigoroso do sulfato dodecyl de sódio detergente aniônico onipresente (SDS), preserva menos robustas oligoméricas formas de agregados de misfolded proteínas que não podem suportar o tratamento de SDS. 9

Anteriormente, nós descrevemos um protocolo de detergente-fracionamento Abreviado que obtiveram resultados comparáveis aos métodos de fracionamento sequencial mais trabalhosos. 5 , omitindo as menos rigorosas etapas de fracionamento, fomos capazes de desenvolver um protocolo facile fracionamento de etapa única para o enriquecimento dos agregados de proteína insolúvel em detergente do cérebro humano após a morte. 5 este protocolo detalhado aqui descrito é bem adequado para uma ampla gama de aplicações experimentais que variam de mancha ocidental e ensaios de espectrometria de massa-baseado proteomics para enrolamento de proteína funcional e propagação de agregação. 5 , 6 , 21

Protocol

declaração de ética: todos os tecidos do cérebro foram obtidos a partir da Emory Alzheimer ' s doença Research Center (ADRC) banco de cérebro. Tecidos humanos após a morte foram adquiridos ao abrigo de protocolos apropriados institucional Review Board (IRB). 1. homogeneização e fracionamento seleção de tecido Nota: congelado o tecido do córtex frontal após a morte de controle saudável (Ctl) e patologicamente casos confirmados de AD foram sel…

Representative Results

O protocolo de sarkosyl de etapa única abreviado-fracionamento foi usado para enriquecer agregados de proteína insolúvel em detergente de controle e o cérebro após a morte de AD (Figura 1). Proteínas de frações TH-S, S1, S2 e P2 foram resolvidas por SDS-PAGE, fixado por 15 min em Coomassie azul reserva fixador seguida de coloração suave com buffer de coloração azul brilhante de Coomassie G-250. A etapa de ressuspensão é opcional, desde que não …

Discussion

Neste documento vamos apresentar e discutir um protocolo de detergente-fracionamento de etapa única Abreviado que é aplicável a uma ampla variedade de aplicações experimentais que variam de análise proteômica de espectrometria de massa-baseado a proteína funcional ensaios de enrolamento e mancha ocidental. 5 , 6 , 7 , 10 esta metodologia é talvez mais eficaz quando usado para estudar p…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores agradecer os Drs Jim Lah e Allan Levey, Emory departamento de Neurologia, sugestões e comentários úteis. Este trabalho foi parcialmente financiado pela parceria de medicina acelerando subvenção (U01AG046161-02), o Emory Alzheimer centro de pesquisa da doença (P50AG025688) e um Instituto Nacional sobre envelhecimento concedem (R01AG053960-01) para N.T.S. Esta pesquisa também foi apoiada em parte pelo núcleo neuropatologia da subvenção Emory neurociência NINDS núcleo instalações, P30NS055077.

Materials

Protease and phosphatase inhibitor cocktail, EDTA-free (100X) Thermo Fisher 78441 protease & phosphatase inhibitor cocktail
Sonic Dismembrator System (ultrasonicator) Fisher Scientific FB505110 microtip ultrasonicator
Optimax TLX Ultracentrifuge Beckman Coulter 361545 refrigerated ultracentrifuge
TLA120.1 rotor Beckman Coulter 362224 ultracentrifuge rotor
500 ul (8x34mm) polycarbonate tubes, thickwall Beckman Coulter 343776 ultracentrifuge tubes for TLA120.1 rotor
4X SDS sample buffer Home-made N/A SDS-PAGE
TCEP solution, neutral pH Thermo Fisher 77720 reducing agent
(TBS) blocking buffer Thermo Fisher 37542 blocking buffer
(TBS) blocking buffer + 0.05% Tween 20 Thermo Fisher 37543 blocking buffer and antibody diluent
4-12% Bolt Bis-Tris Plus gels, 10-well Thermo Fisher NW04120BOX precast SDS-PAGE gels
MES SDS Running Buffer (20X) Thermo Fisher B0002 SDS-PAGE running buffer
N-Lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl) Sigma Aldrich L5777-50G detergent
1.5 ml polypropylene Pellet Pestle Kimble Chase 749521-1500 homogenization tool
cordless motor for Pellet Pestle Kimble Chase 749540-0000 homogenization tool
Anti-Tau-2 (pan tau) antibody Chemicon MAB375 antibodies
Anti-phospho-threonine 231 Tau antibody Millipore MAB5450 antibodies
Anti-phospho-seroine 202 and threonine 205 Tau antibody (AT8) Thermo Fisher MN1020 antibodies
Anti-early endosome antigen 1 (EEA1) antibody abcam ab2900 antibodies
Alexa Fluor 680 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody Thermo Fisher A21058 antibodies
Alexa Fluor 790 donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody Thermo Fisher A11374 antibodies
iBlot2 Dry Blotting System Thermo Fisher IB21001 Gel transfer
iBlot2 Transfer Stacks, Nitrocellulose, mini Thermo Fisher IB23002 Gel transfer

参考文献

  1. Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. Toxic Proteins in Neurodegenerative Disease. Science. 296 (5575), 1991 (1991).
  2. Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature Medicine. 10, S10-S17 (2004).
  3. Ramírez-Alvarado, M., Merkel, J. S., Regan, L. A systematic exploration of the influence of the protein stability on amyloid fibril formation in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (16), 8979-8984 (2000).
  4. Hamley, I. W. The Amyloid Beta Peptide: A Chemist’s Perspective. Role in Alzheimer’s and Fibrillization. Chem Rev. 112 (10), 5147-5192 (2012).
  5. Diner, I., et al. Aggregation Properties of the Small Nuclear Ribonucleoprotein U1-70K in Alzheimer Disease. J. Biol. Chem. 289 (51), 35296-35313 (2014).
  6. Gozal, Y. M., et al. Proteomics Analysis Reveals Novel Components in the Detergent-Insoluble Subproteome in Alzheimer’s Disease. J. Proteome Res. 8 (11), 5069-5079 (2009).
  7. Hales, C. M., et al. Changes in the detergent-insoluble brain proteome linked to amyloid and tau in Alzheimer’s Disease progression. PROTEOMICS. , (2016).
  8. Julien, C., Bretteville, A., Planel, E., Sigurdsson, E. M., Calero, M., Gasset, M. . Amyloid Proteins: Methods and Protocols. , 473-491 (2012).
  9. Nizhnikov, A. A., et al. Proteomic Screening for Amyloid Proteins. PLoS ONE. 9 (12), e116003 (2014).
  10. Seyfried, N. T., et al. Quantitative analysis of the detergent-insoluble brain proteome in frontotemporal lobar degeneration using SILAC internal standards. J. Proteome Res. 11 (5), 2721-2738 (2012).
  11. Woltjer, R. L., et al. Proteomic determination of widespread detergent insolubility, including Aβ but not tau, early in the pathogenesis of Alzheimer’s disease. FASEB J. , (2005).
  12. Miake, H., Mizusawa, H., Iwatsubo, T., Hasegawa, M. Biochemical Characterization of the Core Structure of α-Synuclein Filaments. J. Biol. Chem. 277 (21), 19213-19219 (2002).
  13. Hasegawa, M., et al. Phosphorylated α-Synuclein Is Ubiquitinated in α-Synucleinopathy Lesions. J. Biol. Chem. 277 (50), 49071-49076 (2002).
  14. Neumann, M., et al. Ubiquitinated TDP-43 in Frontotemporal Lobar Degeneration and Amyotrophic Lateral Sclerosis. Science. 314 (5796), 130 (2006).
  15. Bishof, I., Diner, I., Seyfried, N. An Intrinsically Disordered Low Complexity Domain is Required for U1-70K Self-association. FASEB J. 29 (Suppl 1), (2015).
  16. Braak, H., Braak, E. Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathol. 82 (4), 239-259 (1991).
  17. Noguchi, A., et al. Isolation and Characterization of Patient-derived, Toxic, High Mass Amyloid β-Protein (Aβ) Assembly from Alzheimer Disease Brains. J. Biol. Chem. 284 (47), 32895-32905 (2009).
  18. Bai, B., et al. U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer’s disease. Proc. Natl. Acad. Sci. 110 (41), 16562-16567 (2013).
  19. Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. Alzheimer’s β-Amyloid Protein Is Covalently Modified when Dissolved in Formic Acid. J Neurochem. 54 (6), 2050-2056 (1990).
  20. Yang, L. -. S., Gordon-Krajcer, W., Ksiezak-Reding, H. Tau Released from Paired Helical Filaments with Formic Acid or Guanidine Is Susceptible to Calpain-Mediated Proteolysis. J Neurochem. 69 (4), 1548-1558 (1997).
  21. Bai, B., et al. U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer’s disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16562-16567 (2013).
  22. Hales, C. M., et al. U1 small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs) aggregate in Alzheimer’s disease due to autosomal dominant genetic mutations and trisomy 21. Mol Neurodegener. 9 (1), 15 (2014).
  23. Xiong, L. -. W., Raymond, L. D., Hayes, S. F., Raymond, G. J., Caughey, B. Conformational change, aggregation and fibril formation induced by detergent treatments of cellular prion protein. J Neurochem. 79 (3), 669-678 (2001).
  24. Mirra, S. S., et al. The Consortium to Establish a Registry for Alzheimer’s Disease (CERAD). Part II. Standardization of the neuropathologic assessment of Alzheimer’s disease. Neurology. 41 (4), 479-486 (1991).
  25. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
  26. Guo, J. L., et al. Unique pathological tau conformers from Alzheimer’s brains transmit tau pathology in nontransgenic mice. J. Exp. Med. 213 (12), 2635-2654 (2016).
  27. Matveev, S. V., et al. A distinct subfraction of Aβ is responsible for the high-affinity Pittsburgh compound B-binding site in Alzheimer’s disease brain. J Neurochem. 131 (3), 356-368 (2014).

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記事を引用
Diner, I., Nguyen, T., Seyfried, N. T. Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain. J. Vis. Exp. (128), e55835, doi:10.3791/55835 (2017).

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