Слизь, закупоренная воздухоносами пациентов с муковисцидозом (CF), является идеальной средой для развития микробных патогенов. В рукописи описан новый метод изучения микробиома легкого CF в среде, которая имитирует, где они вызывают заболевание, и как изменения химических условий могут стимулировать микробную динамику.
Многие хронические заболевания дыхательных путей в результате закупорки слизи из дыхательных путей. Лёгкий человек с муковисцидозом является примерным случаем, когда их слизистые пробками бронхиол создают благоприятную среду обитания для микробной колонизации. Различные патогенные микроорганизмы процветают в этой среде взаимодействующего друг с другом и движущие многими из симптомов, связанных с болезнью CF. Как и любой микробного сообщества, химические условия их обитания оказывают значительное влияние на структуру и динамику сообщества. Например, различные микроорганизмы процветают в различных уровнях кислорода или других концентраций растворенного вещества. Это также верно и в CF легких, где концентрация кислорода, как полагают, диск сообщества физиологию и структуру. Методы, описанные здесь, предназначены для имитации среды легкой и расти патогенных образом более похожи на то, из чего они вызывают заболевание. Манипулирование химического окружения этих микробов затем используется для изучения того, как в КемиИнтенсивность инфекций легкого определяет ее микробную экологию. Метод, называемый системой WinCF, основан на искусственной среде мокроты и узких капиллярных трубках, предназначенных для обеспечения градиента кислорода, подобного тому, который существует в слизистых бронхиолах. Манипулирование химическими условиями, такими как рН среды мокроты или давлением антибиотиков, позволяет визуализировать микробиологические различия в этих образцах с использованием цветных индикаторов, наблюдать за образованием газа или биопленки или экстрагировать и секвенировать содержание нуклеиновых кислот в каждом образце.
Описано в этой рукописи метод называют систему WinCF 1. Общая цель WinCF заключается в создании экспериментальной установки, способную моделировать среду слизи заполненных бронхиол легкихов. Это позволит для послушной системы для изучения микробных возбудителей заболеваний легких с гиперсекреции слизи фенотипа в том числе муковисцидоз (CF), хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ), астма и другие. Процедура была разработана специально для изучения CF, который характеризуется мутациями , которые вызывают выделения легких , чтобы стать толстыми и трудно очистить, в конце концов заполнение бронхиолы и другие небольшие проходов со слизью 2. Такие закупорки в легких не препятствуют газообмена , потому что вдыхаемый воздух больше не в состоянии достигнуть многих альвеол , а также обеспечивают среду обитания для бактериальной колонизации 3, 4. Невозможность предотвратить рост микробов вЧрезмерная легкая слизь в конечном итоге приводит к развитию сложных хронических инфекций дыхательных путей. Эти сообщества содержат множество организмов, включая вирусы, грибы и бактерии, такие как Pseudomonas aeruginosa , все взаимодействующие друг с другом 5 , 6 , 7 , 8 . Считается, что активность микробиома легкого МВ участвует во вспышках симптомов, называемых обострениями легких 1 , 9 , 10 , 11 . WinCF позволяет изучать поведение микробного сообщества вокруг этих обострений и в настоящее время расширяется, чтобы выступать в качестве базовой экспериментальной системы для изучения микробной экологии легких. Традиционно обострения изучались путем прямого анализа проб, взятых из легких. Много смешающих факторов делают прямой анализ микробного behavior в легкой сложном, с системой WinCF, многие из этих факторов удаляются и поведение микробиома легких может быть изучено более непосредственно, что позволяет более тонкого анализ бактериальной активности в слизи пробок бронхиолы.
Система WinCF обеспечивает способ расти и анализировать бактерии таким образом, что эффективно имитирует среду легких. Традиционные методы выращивания бактерий легкой часто вовлеченные образцы культивирования на традиционных чашках с агаром. Эти методы оставляют образцы открытыми для атмосферного кислорода, пренебрегая для учета гипоксических и часто бескислородных условий в бронхиолах легких , подключенных со слизью 12, 13. Культивирование на агаре в аэробных условиях не что иное, как среды CF легких и может ввести в заблуждение врачей и исследователей относительно поведения патогенов, которые они пытаются лечить. Кроме того, питательные вещества, доступные для бактерий на чашкахОтличаются от имеющихся в фактической мокроте, которая учитывается в WinCF за счет использования искусственной мокроты (ASM). Как показывают культуры Pseudomonas у Sriramulu et al. 14 , ASM включает в себя определенный набор компонентов, который имитирует ресурсы, доступные для микробов мокроты, а также повторяет физическую консистенцию мокроты. Поскольку у больного легкого есть специфический микробиома, изучение таких микроорганизмов в идеале должно происходить и в специфических условиях легкого.
Система WinCF позволяет быстро анализировать и легко манипулировать условиями эксперимента, чтобы наблюдать микробные изменения, похожие на то, как они происходят в фактическом бронхиоле легких. Эта методика позволяет инокулировать несметное число родственных типов образцов, включая мокроту, слюну, другие секреты тела и чистые или смешанные бактериальные культуры. Характер экспериментальной установки позволяет сразу визуально интерпретироватьмикробное поведение сообщества и предназначено для того, чтобы легко наносить вниз по течению от множества микробиологических и omics процедур. Такие исследования имеют важное значение, потому что бактериальные изменения состава сообщества на основе физико-химических условий окружающей их среды. С WinCF химических условий в средствах массовой информации можно манипулировать, чтобы проанализировать влияние на бактериальной активности. Так, например, кислотность в средствах массовой информации может быть изменена перед посевом с образцом. После инкубации бактериальной активности в каждой из этих условий можно непосредственно сравнивать, и могут быть сделаны выводы о том, как бактерии в этих образцах мокроты ведут в ответ на изменения рН. Здесь мы опишем порядок применения системы WinCF и примеры того, как химия СМИ можно манипулировать, чтобы изучить воздействие на микробиомом легких.
Микробиологический состав легкого с CF содержит большое разнообразие организмов, но условия в легких , вероятно , оказывают значительное влияние на то , что виды микробов могут выжить и процветать 13, 15. Конкретные механизмы, с помощью которых эти условия и?…
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы отметить Vertex Pharmaceuticals и Премию за инновации в области кистозного фиброза для финансирования Р. Куинна и NIH / NIAID для финансирования гранта 1 U01 AI124316-01, подхода системной биологии к лечению мультирезистентных патогенов. Мы также хотели бы поблагодарить Департамент механической и аэрокосмической инженерии UCSD за курс обучения старшему инженерному делу в области машиностроения для содействия сотрудничеству с инженерными аспектами этой работы.
Color-Coded Capillary Tubes | Fisher Scientific | 22-260943 | |
Cha-seal Tube Sealing Compound | Kimble-Chase | 43510 | |
Mucin from porcine stomach | Sigma | M1778 | |
Ferritin, cationized from horse spleen | Sigma | F7879 | |
Salmon sperm DNA Sodium salt (sonified) | AppliChem Panreac | A2159 | |
MEM Nonessential Amino Acids | Corning cellgro | 25-025-CI | |
MEM Amino Acids | Cellgro | 25-030-CI | |
Egg Yolk Emulsion, 50% | Dalynn Biologicals | VE30-100 | |
Potassium Chloride | Fisher Scientific | P2157500 | |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271500 | |
15mL centriguge tubes with Printed Graduations and Flat Caps | VWR | 89039-666 | |
50mL centrifuge tubes with Printed Graduations and Flat Caps | VWR | 89039-656 | |
1.5mL microcentrifuge tubes | Corning | MCT-150-R | |
2.0mL microcentrifuge tubes | Corning | MCT-200-C |