O muco das vias respiratórias ligado de fibrose cística (FC) pacientes são um ambiente ideal para agentes patogénicos microbianos prosperar. O manuscrito descreve um novo método para estudar a microbiome CF pulmão num ambiente que imita onde causam doença e como alterações de condições químicas pode conduzir dinâmica microbianas.
Muitas doenças crônicas das vias aéreas resultam em obstrução do muco das vias aéreas. Os pulmões de um indivíduo com fibrose cística são um caso exemplar onde seus bronquíolos obstruídos pelo muco criam um habitat favorável para a colonização microbiana. Vários agentes patogénicos prosperam neste ambiente interagindo uns com os outros e conduzindo muitos dos sintomas associados com doença de FC. Como qualquer comunidade microbiana, as condições químicas de seu habitat têm um impacto significativo na estrutura e dinâmica da comunidade. Por exemplo, diferentes microrganismos prosperam em diferentes níveis de oxigénio ou outras concentrações de soluto. Isto também é verdade no pulmão de FQ, onde se acredita que as concentrações de oxigênio conduzem a fisiologia e estrutura da comunidade. Os métodos descritos aqui são projetados para imitar o ambiente pulmonar e gerar patógenos de uma maneira mais semelhante àquela de que eles causam a doença. Manipulação do ambiente químico desses micróbios é então usado para estudar como o chemistry de infecções pulmonares regula a sua ecologia microbiana. O método, chamado o sistema WinCF, baseia-se em meio de expectoração artificial e tubos capilares estreitos destinam a proporcionar um gradiente de oxigénio similar ao que existe no bronquíolos ligado de muco. Manipulando as condições químicas, tais como o pH do meio da expectoração ou antibióticos pressão, permite a visualização das diferenças microbiológicos nas amostras utilizando indicadores coloridos, para observação de gás ou de biofilme de produção, ou extracção e sequenciando os teores de ácidos nucleicos de cada amostra.
O método descrito neste manuscrito é chamado de sistema WinCF 1 . O objetivo geral do WinCF é fornecer uma instalação experimental capaz de simular o ambiente de um bronquíolo pulmonar cheio de muco. Isto permitirá um sistema de tratamento para estudar patógenos microbianos de doenças pulmonares com um fenótipo de hipersecreção de muco incluindo fibrose cística (FC), doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), asma e outros. O procedimento foi projetado especificamente para o estudo da FC, que é caracterizada por mutações que causam secreções pulmonares para tornar-se espessa e difícil de limpar, eventualmente enchimento bronquíolos e outras pequenas passagens com muco 2 . Tais bloqueios no pulmão inibem a troca de gases porque o ar inalado não é mais capaz de atingir muitos alvéolos e também proporcionar um habitat para colonização bacteriana 3 , 4 . A incapacidade de prevenir o crescimento microbianoO excesso de muco pulmonar leva eventualmente ao desenvolvimento de infecções crónicas complexas das vias aéreas. Estas comunidades contêm uma variedade de organismos, incluindo vírus, fungos e bactérias como Pseudomonas aeruginosa , todos interagindo uns com os outros 5 , 6 , 7 , 8 . Acredita-se que a atividade do microbioma pulmonar da FC esteja envolvida em crises de sintomas denominadas exacerbações pulmonares 1 , 9 , 10 , 11 . WinCF permite o estudo do comportamento da comunidade microbiana em torno dessas exacerbações e agora está sendo expandido para atuar como um sistema experimental de base para estudar a ecologia microbiana pulmonar. Tradicionalmente, as exacerbações foram estudadas através da análise direta de amostras retiradas do pulmão. Muitos fatores de confusão fazem análise direta do microbiano bComportamento no pulmão desafiando, com o sistema WinCF, muitos desses fatores são removidos eo comportamento do microbioma pulmonar pode ser estudado mais diretamente, permitindo uma análise mais fina da atividade bacteriana em um muco-plugged bronchiole.
O sistema WinCF fornece um método para crescer e analisar as bactérias de uma forma que efetivamente imita o ambiente pulmonar. Os métodos tradicionais para o cultivo de bactérias pulmonares envolvem frequentemente a cultura de amostras em placas de agar tradicionais. Esses métodos deixam as amostras abertas ao oxigênio atmosférico, negligenciando a explicação das condições hipóxicas e muitas vezes anóxicas encontradas nos bronquíolos pulmonares obstruídos pelo muco 12,13 . A cultura em ágar sob condições aeróbicas não é nada como o ambiente do pulmão de FQ e pode induzir em erro os clínicos e pesquisadores quanto ao comportamento dos patógenos que eles estão tentando tratar. Além disso, os nutrientes disponíveis para bactérias em placas de ágarSão diferentes daquelas disponíveis no escarro real, o que é explicado no WinCF através da utilização de meios de escarro artificial (ASM). Tal como demonstrado pelas culturas de Pseudomonas em Sriramulu et al. 14 , ASM inclui um conjunto específico de componentes que imita os recursos disponíveis para os micróbios de expectoração e também reproduz a consistência física do escarro. Porque um pulmão doente tem um microbiome específico, o estudo de tais microorganisms deve ocorrer idealmente nas circunstâncias específicas do pulmão também.
O sistema WinCF permite uma análise rápida e fácil manipulação das condições experimentais para observar alterações microbianas semelhantes à forma como elas ocorreriam em um bronquíolo pulmonar real. Esta técnica permite a inoculação de uma miríade de tipos de amostras relacionadas incluindo escarro, saliva, outras secreções corporais e culturas bacterianas puras ou misturadas. A natureza da configuração experimental permite uma interpretação visual imediataO comportamento da comunidade microbiana e é projetado para permitir a fácil aplicação a jusante de uma infinidade de procedimentos microbiológicos e ósmicos. Tais estudos são importantes porque a composição da comunidade bacteriana muda com base nas condições físico-químicas de seu ambiente. Com WinCF as condições químicas da mídia podem ser manipuladas para analisar os efeitos sobre a atividade bacteriana. Por exemplo, a acidez do meio pode ser alterada antes da inoculação com uma amostra. Após a incubação, a actividade bacteriana em cada uma destas condições pode ser directamente comparada, e as conclusões podem ser tiradas sobre como as bactérias nessas amostras de escarro se comportam em resposta ao pH variável. Aqui, descrevemos os procedimentos para aplicar o sistema WinCF e exemplos de como a química dos meios pode ser manipulada para estudar os efeitos sobre o microbioma pulmonar.
A composição microbiológica de um pulmão com CF contém uma grande variedade de organismos, mas as condições dentro do pulmão provavelmente tem uma influência significativa sobre que tipos de micróbios podem sobreviver e prosperar 13, 15. mecanismos específicos através dos quais essas condições mudam e os efeitos exatos que têm sobre o microbioma pulmão são geralmente desconhecido até o momento. Neste método experimental, é apresentada uma an?…
The authors have nothing to disclose.
Os autores gostariam de agradecer Vertex Pharmaceuticals e o Prêmio Inovação Tecnológica em Fibrose Cística para financiar R. Quinn e do NIH / NIAID para o financiamento da concessão 1 U01 AI124316-01, uma abordagem de biologia de sistemas para tratamento de patógenos resistentes a múltiplas drogas. Gostaríamos também de agradecer ao Departamento de Engenharia Mecânica e Aeroespacial no curso de design sênior de engenharia mecânica de graduação da UCSD para facilitar a colaboração com os aspectos de engenharia deste trabalho.
Color-Coded Capillary Tubes | Fisher Scientific | 22-260943 | |
Cha-seal Tube Sealing Compound | Kimble-Chase | 43510 | |
Mucin from porcine stomach | Sigma | M1778 | |
Ferritin, cationized from horse spleen | Sigma | F7879 | |
Salmon sperm DNA Sodium salt (sonified) | AppliChem Panreac | A2159 | |
MEM Nonessential Amino Acids | Corning cellgro | 25-025-CI | |
MEM Amino Acids | Cellgro | 25-030-CI | |
Egg Yolk Emulsion, 50% | Dalynn Biologicals | VE30-100 | |
Potassium Chloride | Fisher Scientific | P2157500 | |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271500 | |
15mL centriguge tubes with Printed Graduations and Flat Caps | VWR | 89039-666 | |
50mL centrifuge tubes with Printed Graduations and Flat Caps | VWR | 89039-656 | |
1.5mL microcentrifuge tubes | Corning | MCT-150-R | |
2.0mL microcentrifuge tubes | Corning | MCT-200-C |