マウスは、超音波声質化(USV)の複雑なマルチ音節レパートリーを生成する。これらのUSVは、神経精神医学的障害のための情報として広く使用されている。このプロトコルは、マウスの歌の音響的特徴および構文を一貫して誘起し、収集し、分析するために、我々が学んだ、および開発したいくつかのプラクティスを記載している。
マウスは、発達および成人期を通じて、様々な社会的状況において超音波声帯(USV)を生成する。これらのUSVは、マザーポップ検索1 、少年インタラクション2 、同じ性交渉3,4,5、および領域相互作用6に使用される 。数十年間、USVは、脊椎動物10の声通信のメカニズムと進化を理解するために、神経精神医学的発達障害または行動障害7,8,9を研究するためのプロキシとして研究者によって使用されてきた10 。性的相互作用の中で、成体の雄のマウスは、歌鳥11の求愛歌に類似するいくつかの特徴を有するUSV歌を生み出す。そのような複数音節のレーパーの使用彼らは、要素がどのように編成され再結合されるか、つまり構文が異なることがあるので、潜在的な柔軟性と情報を増やすことができます。このプロトコルでは、新鮮な女性の尿、麻酔した動物、および発情の女性への暴露など、さまざまな社会的状況で雄マウスからUSVソングを引き出す信頼できる方法が説明されています。これには、マウスから大量の音節を誘導する条件が含まれます。安価な音場で周辺雑音の記録を減らし、USVを自動的に検出、分類、分析するための定量方法を提示します。後者は、コールレート、ボーカルレパートリー、音響パラメータ、および構文の評価を含む。特定の歌のタイプに対する動物の嗜好を研究するために再生を使用することに関する様々なアプローチおよび洞察が記載される。これらの方法は、雄マウスの異なる状況、および雌マウスの歌嗜好に関する音響および構文の変化を記述するために使用された。
人間と比較して、マウスは低音と高音の両方の発声を生成します。後者は、聴力範囲を超える超音波発声(USV)として知られています。 USVは、母親の妊娠の回復、少年の相互作用から、反対のまたは同じ性交渉の成人への相互作用4,12など、さまざまな状況で生み出されている。これらのUSVは、手作業で自動的に分類することができる多様なマルチ音節のレパートリーから構成されています( 10または11) 。近年、これらのUSVの通信における役割はますます深まっている。これらには、神経精神医学、発達障害または行動障害7,8 、および内部の動機づけ/感情状態13のマウスモデルの表示としてUSVを使用することが含まれる13 。 USVは信頼できる情報をeに伝えると考えられているレシーバ14,15にとって有用なミッタの状態である。
2005年、HolyとGuo 11は、大人の雄のマウスUSVが、鳴き鳥に類似した複数音節の呼び出し要素または音節の連続として編成されたという考えを進歩させました。多くの種では、マルチ音節のレパートリーにより、エミッタは、ソングによって運ばれる可能性のある情報を増やすために異なる方法で音節を結合して順序付けることができます。この構文のバリエーションは、性行動や仲間の選好に影響を及ぼすと考えられている16,17 。その後の研究では、雄のマウスが、女性の存在の前、中、後に生成する音節型の相対的な組成を変えることができたことが示された5,18。すなわち、成体雄マウスは、USVを使用して求愛行動を誘発するまたは女性との密接な接触を維持すること、または交配を容易にすること19,20,21 。彼らはまた、男性 – 男性の相互作用でも放出され、おそらく相互作用の間に社会情報を伝達する4 。レパートリーにおけるこれらの変化を捕らえるために、科学者は通常、スペクトル特性(振幅、周波数などの音響パラメータ)、USV音節数または呼数、および最初のUSVに対する待ち時間を測定する。しかし、実際にこれらのUSVのシーケンスダイナミクスを詳細に見るものはほとんどありません22 。最近、我々のグループは、USV音節系列の動的変化を測定する新しい方法を開発した23 。私たちは、歌の中の音節の順序(つまりシンタックス)は無作為ではなく、社会的な文脈によって変化し、聞き取りの動物はこれらの変化を人工的に関連するものとして検出することを示した。
我々はthに注意する動物のコミュニケーションを研究している多くの研究者は、人間の発話に使用されている構文と正確に同じ意味で、「構文」という用語に付いていません。動物のコミュニケーション研究では、いくつかの規則で順序付けられた非ランダムな一連の音を意味します。さらに、ヒトについては、特定の配列が特定の意味を有することが知られている。これがマウスに当てはまるかどうかはわかりません。
このペーパーと関連するビデオでは、さまざまな状況でUSVの雄マウスを記録し、再生を行うための信頼性の高いプロトコルを提供することを目指しています。逐次使用される3つのソフトウェアの使用:1)自動録音。 2)音節の検出と符号化。 3)音節の特徴と構文の詳細な分析が実証されている( 図1 )。これにより、雄性マウスのUSV構造と機能についてより多くのことを学ぶことができます。このような方法はデータ分析を容易にし、mouの正常および異常な声のコミュニケーションを特徴付ける際に新しい地平を開けてくれると信じているコミュニケーションおよび神経精神障害のモデルをそれぞれ示している。
このプロトコルは、様々な大部分の女性関連刺激に亘って、実験室での雄マウスの求愛発声を収集し、定量し、研究するためのアプローチを提供する。 Chabout、 et al。代表的な結果では、この方法を使用することにより、受信する女性にとって重要な文脈依存の発声および構文を発見することができました。これらの刺激の標準化は、信頼できる数のUSVの収集を提供し、男性の求愛歌とレパートリーの詳細な分析を可能にする。
生きている女性が男性と一緒にいるとき、プロトコルは私たちが発声のエミッタをはっきりと識別することを許さない。しかし、これまでの研究では、このような状況で放出された発声の大部分は男性26,29人であったことが示されています。同種の(男性または女性の)男性の刺激として、これらの文脈における女性の発声の量は、4,5,22,30と無視できると考えている。しかし、近年の論文では、グループ収容条件31のエミッタの発声を局在化するための三角測量を用いており、ダイアダ内では女性がUSVの約10%に寄与していることが示されている。本プロトコルでは、麻酔された女性の使用により、ユーザは、彼女の発声をせずに女性の存在下で男性の発声を研究することができる。この最近の研究31の期待とは対照的に、我々は、FEとAFの条件23の間に放出された音節の数に差がないことを発見した23 。生きた雌が記録に有意に寄与しなかったこと、または雌が麻酔をかけられたfemに対して生存している雌の存在下で声があまり発声されなかった可能性があるエール。それにもかかわらず、将来の実験では、この三角測量法を使用して女性の貢献の潜在的な影響を評価することを検討すべきであると考えている。
私たちが概説したいくつかのステップを実行できる他のソフトウェアがありますが、ソフトウェアA、ソフトウェアBを使用するマウス・ソング・アナライザー・ソフトウェア・スクリプトC、例えば、最近の論文では、ユーザがソノグラムから音響変数を自動的に抽出するか、または手動であったユニットに直接音声変数を抽出することを可能にするVoICEというソフトウェアが提案されているユーザ32によって選択される。しかし、自動または半自動の配列解析は、我々のアプローチほど詳細ではありません。いくつかの市販のソフトウェアは、音響的特徴を自動的に分析することができるが、音節のアトミックな分類。その後、ユーザは異なる音節をソートしなければならない。 Grimsley、Gadziola、 et al。 33は、共通の音響機能に基づいて音節をクラスタリングするが、音節の自動検出を提供しない、テーブルベースの仮想マウスボーカルオルガンプログラムを開発した。彼らのプログラム34は、マルコフモデルを使用して録音された曲から新しいシーケンスを作成するという点でユニークで、簡単な編集よりも高度な機能を備えています。
マウスでの以前のコミュニケーション研究のほとんどはエミッタの側面35,36に焦点を当てている。受信機の側面を調査した研究はほとんどない30,37,38。再生および識別プロトコルは、Asaba、Kato、 etによって最近記載されたような受信側の側面を研究するための簡単なテストを提供するal。 39 。この研究では、著者らは、ここで説明したY字型の迷路の代わりに音響フォームで区切られた2つの選択肢のテストボックスを使用しました。どちらの選択設定にも長所と短所があります。まず、Y字型の迷路は音を一方の腕から他方の腕に分離するのではなく、2つの選択肢のボックスが音を分離します。しかし、Y字型の迷路のデザインを使用することで、動物は同時に演奏される2つの曲をすぐに評価し、好みの曲に向かって移動することができます。それにもかかわらず、再生実験は一般に、実験動物が特定の動物のために生成される発声の意味および機能を決定するのに役立つ。結論として、このプロトコルの技術を習得し、分析した後、読者はマウスUSVの文脈、遺伝学、神経生物学に影響を与える多くの問題に取り組むことができるはずです。
B6D2F1 / Jマウスを使用して、女性関連刺激は、ほとんど常に我々の研究室で試験した男性のUSVを誘発する。それは、強力な統計的分析を得るためには十分な音節(5分で> 100)が必要です。トラブルシューティングのために、USVが記録されていない(または不十分な)場合は、サウンドが記録されていることを確認するために設定をチェックしてください。刺激の導入後にコンピュータスクリーン上でリアルタイムソノグラムを見ることによって、記録中にケージ内で起こっていることの生の検査を行う。それ以外の場合は、性的に成熟した/受容性のある女性に男性を一晩再曝露させてから、数日間または1週間以内にそれらを単独で収容してから再度記録してください。日常的な観察に基づいて、ある男性は(ほぼ完全に5分間)1日に多くの歌をし、次の日はあまりありません。我々は、そのような被験体の変動が生じる理由を知らないが、それはおそらく男性の動機付けまたは季節性であり、女性の尿の発情状態であると推測する。 USVが記録されていない場合は、動物を複数日に記録して、これらの変動効果を拾い上げてください。 Unl私たちは歌の鳥の中で、時間に基づいて歌う量の明白な違いに気づいていません。我々は、男性が7週前にはあまり歌わない(5分で100音節以下)ことを発見した。
ここに示された検出方法は、何千もの音節とすべての音響パラメータを数分で抽出することができます。しかし、どのような自動検出方法でも、バックグラウンドノイズに非常に敏感です。雑音の多い録音(例えば寝具で録音した動物など)のマウスソングアナライザー検出ソフトウェアを使用すると、より柔軟性を持たせるために検出「スレッショルド」を調整する必要があります。しかし、これは偽陽性の音節の数も増加させ、自動検出が失敗する可能性があります。このような状況下では、手作業でコーディングすることができます。
前述のように、発声の数、レパートリー、およびレイテンシーは、歪みに応じて広範囲に変化するため、パラメータ(記録長、刺激、自動音節検出など )を使用して、統計解析のための最適な記録を保証する。
The authors have nothing to disclose.
この作業は、EDJへのHoward Hughes Medical Instituteの資金によって支えられました。私たちはPrに感謝します。 Sylvie Granon(NeuroPSI – University Paris south XI – FRANCE)は、スピーカーのハードウェアを貸してくれました。 Jarvis Labのメンバーには、この作業に関するサポート、ディスカッション、修正、コメント、特にジョシュア・ジョーンズ・マコープン(Joshua Jones Macopson)のフィギュアやテストのサポートに感謝します。 Dr. Gustavo Arriagaがマウスソングアナライザーソフトウェアを手助けし、私たちのためにV1.3にアップグレードしました、そしてこのプロトコルの他の側面に感謝します。ソフトウェアのv1.0は、ArriagaによってHolyとGuo、v1.1とv1.3によって開発されました。
Sound proof beach cooler | See Gus paper has more info on specific kind | Inside dimensions (L 27 x W 23 x H 47 cm): | |
Condenser ultrasound microphone CM16/CMPA | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #40011 | Includes extension cable |
Ultrasound Gate 1216H sound card | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #34175 | 12 channel sound card |
Ultrasound Gate Player 216H | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #70117 | 2 channels playback player |
Ultrasonic Electrostatic Speaker ESS polaroid | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #60103 | 2 playback speakers |
Test cage | Ace | #PC75J | 30 x 8 x 13 cm height; plexiglas |
plexiglas separation | home made | – | 4 x 13 cm plexiglas with 1cm holes |
Video camera | Logitech | C920 | logitech HD Pro webcam C920 |
Heat pad | Sunbeam | 722-810-000 | |
Y-maze | Home made | – | Inside dimensions (L 30 x W 11 x H 29 cm): |
Tweezers | |||
Software | |||
Avisoft Recorder (Software A) | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #10101, #10111, #10102, #10112 | http://www.avisoft.com |
MATLAB R2013a (Software B) | MathWorks | – | MATLAB R2013a (8.1.0.604) |
Mouse Song Analyzer v1.3 (Software C) | Custom designed by Holy, Guo, Arriaga, & Jarvis; Runs with software B | http://jarvislab.net/wp-content/uploads/2014/12/Mouse_Song_Analyzer_v1.3-2015-03-23.zip | |
Microsoft Office Excel 2013 (Software D) | Microsoft | – | Microsoft Office Excel |
Song Analysis Guide v1.1 (Software E) | Custom designed by Chabout & Jarvis. Excel calculator sheets, runs with software D | http://jarvislab.net/wp-content/uploads/2014/12/Song-analysis_Guided.xlsx | |
Syntax decorder v1.1 (Software F) | Custom designed by Sakar, Chabout, Dunson, Jarvis – in R studio | https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/ | |
Graphiz (Software G) | AT&T Research and others | http:// www.graphviz.org; | |
Avisoft SASLab (Software H) | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #10101, #10111, #10102, #10112 | http://www.avisoft.com |
Reagents | |||
Xylazine (20mg/ml) | Anased | – | |
Ketamine HCL (100mg/ml) | Henry Schein | #045822 | |
distilled water | |||
Eye ointment | Puralube Vet Ointment | NDC 17033-211-38 | |
Cotton tips | |||
Petri dish |