小鼠产生超声发声(USV)的复杂多音节曲目。这些USV被广泛用作神经精神障碍的读数。该协议描述了我们学习和开发的一些实践,以始终如一地引导,收集和分析鼠标歌曲的声学特征和语法。
在整个发展和成年期间,小鼠在各种社会环境中产生超声发声(USV)。这些USV用于母婴检索1 ,少年交互2 ,相反和相同的性交互3,4,5和领土交互6 。几十年来,USVs被调查人员用作研究神经精神和发育障碍或行为障碍7,8,9 ,最近才了解脊椎动物之间的声音通信的机制和演变10 。在性交互作用中,成年雄性小鼠产生USV歌曲,其中有一些类似于歌鸟11的求爱歌曲的功能。使用这种多音节乐器可以增加他们携带的潜在的灵活性和信息,因为它们可以在元素如何组织和重组中变化,即语法。在该协议中,描述了在各种社会环境中引出来自雄性小鼠的USV歌曲的可靠方法,例如暴露于新鲜的女性尿液,麻醉的动物和发情女性。这包括从小鼠中诱导大量音节的条件。我们通过廉价的音箱减少环境噪音的记录,并提出了一种自动检测,分类和分析USV的量化方法。后者包括呼叫率,声乐曲目,声学参数和语法的评估。描述了使用播放来研究动物对特定歌曲类型的偏好的各种方法和洞察。这些方法用于描述男性小鼠不同背景下的声学和语法变化,以及女性小鼠的歌曲偏好。
相对于人类,小鼠产生低频和高频发声,后来被称为高于我们的听力范围的超声发声(USV)。 USVs是在各种情况下生产的,包括从母婴检索,青少年互动,到相反或同性成人的交互4,12。这些USV由多种多音节曲目组成,可以手动分类9或自动分类10,11 。近年来,这些USV在交流中的作用日益增加。这些包括使用USV作为神经精神,发育或行为障碍7,8以及内部动机/情绪状态的小鼠模型的阅读。 USV被认为在e上传达可靠的信息mitter的状态对于接收器14,15是有用的。
2005年,Holy和Guo 11提出了成年男性小鼠USVs被组织为连续的多音节调用元素或类似于鸣鸟的音节的想法。在许多物种中,多音节曲目允许发射器以不同的方式组合和排序音节,以增加歌曲携带的潜在信息。这种语法的变化被认为具有与性行为和伴侣偏好有关的病理学意义16,17 。随后的研究表明,雄性小鼠能够改变在女性5,18之间,之前和之后产生的音节类型的相对组成。也就是说,成年男性小鼠使用他们的USV进行求偶行为,以吸引或与女性保持紧密接触,或促进交配19,20,21 。他们也是在男性与男性的互动中排除,可能在交互过程中传达社会信息4 。为了捕捉这些变化,科学家通常测量光谱特征(声学参数,如振幅,频率等 ),USV音节数或呼叫数,以及第一个USV的延迟。然而,很少有人仔细看这些USV的序列动态22 。最近我们的小组开发了一种测量USV音节序列23动态变化的新方法。我们表明,一首关于(即语法)的歌曲中的音节顺序不是随机的,它根据社会语境而变化,听力动物将这些变化发现为病理学相关性。
我们注意到在许多研究动物传播的调查人员,并没有将术语“语法”与人类言语中使用的语法相同的确切含义。对于动物交流研究,我们只是用一些规则来表示有序,非随机的声音序列。此外,对于人来说,已知特定的序列具有特定的含义。我们不知道这是否是老鼠的情况。
在本文和相关视频中,我们的目标是提供可靠的协议来记录雄性小鼠在各种环境下的求爱USV,并执行播放。使用三个顺序使用的软件:1)自动录音; 2)音节检测和编码;和3)对音节特征和语法的深入分析被证明( 图1 )。这使我们能够了解更多有关雄性小鼠USV结构和功能的信息。我们认为,这样的方法可以缓解数据分析,并可能开辟新的视野,以表征缪尔正常和异常的声音通信分别通信和神经精神障碍模型。
该方案提供收集,量化和研究实验室中各种大多数女性相关刺激的雄性小鼠求爱发声的方法。如之前在Chabout, et al。在代表性的结果中,使用这种方法使我们能够发现与接收女性相关的上下文相关发声和语法。这些刺激的标准化将提供可靠数量的USV的收集,并允许详细分析男性的求爱歌曲和曲目。
当一个活着的女性与男性在一起时,协议不允许我们清楚地识别发声器的声音。然而,以前的研究表明,大多数在这种情况下发出的发声是男性26 29 。大多数使用特定(男性或女性)作为男性的刺激,相信在这些情况下,女性发声的数量可以忽略不计4,5,22,30。然而,最近的一篇论文使用三角测量来定位群体居住条件中发射器的发声31 ,并表明在一个二进制中,女性贡献了约10%的USV。在本议定书中,使用麻醉的女性允许用户在没有她的发声的情况下研究女性在场的男性发声。与最近的研究31的预期相反,我们发现FE和AF条件之间发音的音节数量没有差异23 。活的女性可能没有显着地贡献录音,或男性在活着的女性与麻醉的女性的存在下发出较少的声音啤酒。然而,我们认为,未来的实验应考虑使用这种三角测量方法来评估女性贡献的潜在影响。
还有其他可用的软件可以做一些我们所概述的步骤,尽管我们不相信我们使用三个程序组合的问题的方式足够:软件A,鼠标乐谱分析器软件脚本C使用软件B,使用自定义电子表格软件D + E计算的语法分析软件,以及使用R的语法解码顺序。例如,最近的一篇文章提出了一种名为VoICE的软件,该软件允许用户从声像图自动提取声变量,或者直接在手动单元上提取声变量由用户32选择。但是,自动或半自动序列分析并不像我们的方法那么详细。一些商业软件可以自动分析声学特征,但不提供自动化音节的分类;用户之后必须对不同的音节进行排序。 Grimsley,Gadziola, et al。 33开发了一种基于表的虚拟鼠标声乐器程序,其基于共享声学特征聚集音节,但不提供音节的自动检测。他们的节目34是独特的,因为它使用马尔可夫模型从录制的歌曲创建新的序列,因此具有比简单编辑更高级的特征。
大多数以前关于小鼠的沟通研究集中在发射体的侧面35,36 。很少有研究探讨了接收方30,37,38 。播放和辨别协议提供了一个简单的测试来研究接收方,如最近由Asaba,Kato 等人描述的人。 39 。在这项研究中,作者使用了一个双声道测试箱,用隔音泡沫代替这里描述的Y型迷宫盒。两种选择设置都有优缺点。首先,Y迷宫不会将声音从一个手臂隔离到另一个手臂,而是双选框。然而,通过使用Y迷宫设计,动物可以快速评估同时播放的两首歌曲,并向首选方向移动。然而,回放实验通常帮助实验者确定为特定动物产生的声音的意义和功能。总之,掌握本协议的技术和分析之后,读者应该能够解决影响小鼠USV的背景,遗传和神经生物学的许多问题。
使用B6D2F1 / J小鼠,女性相关刺激几乎总是触发我们在实验室测试的男性的USV。对于大学来说至关重要ct足够的音节(> 5分钟> 100)可以获得强大的统计学分析。对于故障排除,如果没有记录USV(或不足够),请检查配置以确保记录声音。在进行刺激后,通过观察计算机屏幕上的实时超声波图像,对录像过程中发生的情况进行现场检查。否则,尝试将男性重新暴露于性成熟/接受性的女性一夜之间,然后将他们独自存放数天或长达一周,然后再录制。根据轶事观察,我们发现有一些男性在一天(几乎全部5分钟)唱了很多,第二天没有多少,然后再一天。我们不知道为什么会出现主题变异的原因,但我们认为这可能是男性的动机或季节性,女性尿液的发情状态。如果没有记录USV,请尝试在几天内记录动物以接收这些可变效应。 UNL在鸣鸟中,我们没有注意到基于时间的歌唱量的明显差异。我们发现,在7周龄之前,男性不会唱多少(5分钟内<100个音节)。
这里提出的检测方法可以在几分钟内提取数千个音节和所有的声学参数。但是作为任何自动检测方法,它对背景噪声非常敏感。使用具有嘈杂录音的鼠标乐谱分析仪检测软件(例如从记录有床上用品的动物)可能需要调整检测“阈值”以允许更多的灵活性。然而,这也将增加假阳性音节的数量,并且自动检测可能会失败。在这种情况下,可以使用手动编码。
如前所述,根据应变,发声的数量,余数和延迟量变化很大,因此可能需要改变参数(记录长度,刺激,自动音节检测等 ),以确保用于统计分析的最佳记录。
The authors have nothing to disclose.
霍华德·休斯医学研究所资助EDJ的这项工作得到了支持。我们感谢Pr。 Sylvie Granon(NeuroPSI – 大学巴黎南XI – 法国)为我们提供扬声器硬件。我们还感谢Jarvis实验室的成员对这项工作的支持,讨论,更正和评论,特别是Joshua Jones Macopson的帮助和数据和测试。我们感谢Gustavo Arriaga博士对Mouse Song Analyzer软件的帮助,将其升级到V1.3,以及此协议的其他方面。该软件的v1.0由Holy和Guo开发,v1.0和v1.3由Arriaga开发。
Sound proof beach cooler | See Gus paper has more info on specific kind | Inside dimensions (L 27 x W 23 x H 47 cm): | |
Condenser ultrasound microphone CM16/CMPA | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #40011 | Includes extension cable |
Ultrasound Gate 1216H sound card | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #34175 | 12 channel sound card |
Ultrasound Gate Player 216H | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #70117 | 2 channels playback player |
Ultrasonic Electrostatic Speaker ESS polaroid | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #60103 | 2 playback speakers |
Test cage | Ace | #PC75J | 30 x 8 x 13 cm height; plexiglas |
plexiglas separation | home made | – | 4 x 13 cm plexiglas with 1cm holes |
Video camera | Logitech | C920 | logitech HD Pro webcam C920 |
Heat pad | Sunbeam | 722-810-000 | |
Y-maze | Home made | – | Inside dimensions (L 30 x W 11 x H 29 cm): |
Tweezers | |||
Software | |||
Avisoft Recorder (Software A) | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #10101, #10111, #10102, #10112 | http://www.avisoft.com |
MATLAB R2013a (Software B) | MathWorks | – | MATLAB R2013a (8.1.0.604) |
Mouse Song Analyzer v1.3 (Software C) | Custom designed by Holy, Guo, Arriaga, & Jarvis; Runs with software B | http://jarvislab.net/wp-content/uploads/2014/12/Mouse_Song_Analyzer_v1.3-2015-03-23.zip | |
Microsoft Office Excel 2013 (Software D) | Microsoft | – | Microsoft Office Excel |
Song Analysis Guide v1.1 (Software E) | Custom designed by Chabout & Jarvis. Excel calculator sheets, runs with software D | http://jarvislab.net/wp-content/uploads/2014/12/Song-analysis_Guided.xlsx | |
Syntax decorder v1.1 (Software F) | Custom designed by Sakar, Chabout, Dunson, Jarvis – in R studio | https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/ | |
Graphiz (Software G) | AT&T Research and others | http:// www.graphviz.org; | |
Avisoft SASLab (Software H) | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #10101, #10111, #10102, #10112 | http://www.avisoft.com |
Reagents | |||
Xylazine (20mg/ml) | Anased | – | |
Ketamine HCL (100mg/ml) | Henry Schein | #045822 | |
distilled water | |||
Eye ointment | Puralube Vet Ointment | NDC 17033-211-38 | |
Cotton tips | |||
Petri dish |