概要

Visualisatie van Twitching Beweeglijkheid en karakterisering van de rol van de<em> PilG</em> in<em> Xylella fastidiosa</em

Published: April 08, 2016
doi:

概要

In deze studie werd een nano-microfluïdische stroom kamer gebruikt om te visualiseren en functioneel karakteriseren het trillen beweeglijkheid van Xylella fastidiosa, een bacterie die de ziekte van Pierce veroorzaakt in Grapevine.

Abstract

Xylella fastidiosa is een Gram-negatieve non-flagellen bacterie die een aantal economisch belangrijke ziekten bij planten veroorzaakt. De spiertrekkingen beweeglijkheid biedt X. fastidiosa een middel voor de lange afstand intra-fabriek beweging en kolonisatie, bij te dragen in de richting van pathogeniciteit in X. fastidiosa. Het trillen beweeglijkheid van X. fastidiosa wordt beheerd door type IV pili. Type IV pili van Xylella fastidiosa worden geregeld door pilG, een chemotaxis regulator in Pil-Chp operon dat codeert voor eiwitten die betrokken zijn bij signaaltransductie. Om de rol van pilG verhelderen in het trillen beweeglijkheid van X. fastidiosa, een pilG deficiënte mutant Xf ΔpilG en zijn complementaire stam XfΔpilG- C met inheemse pilG werden ontwikkeld. Een microfluïdische kamers geïntegreerd met een time-lapse beeldopname systeem werd gebruikt om spiertrekkingen beweeglijkheid observeren XfΔpILG XfΔpilG- C en de wild-type stam. Met behulp van deze opname systeem, het maakt het mogelijk de lange termijn ruimtelijke en temporele observaties van aggregatie, migratie van individuele cellen en populaties van bacteriën via trillen beweeglijkheid. X. fastidiosa wild type en complementaire XfΔpilG- C-stam toonde typische trillen beweeglijkheid kenmerken rechtstreeks waargenomen in de microfluïdische stroom kamers, terwijl mutant XfΔpliG tentoongesteld de spiertrekkingen deficiënt fenotype. Deze studie toont aan dat pilG bijdraagt ​​aan het trillen beweeglijkheid van X. fastidiosa. De microfluïdische stroom kamer wordt gebruikt als een middel voor het waarnemen twitching beweeglijkheid.

Introduction

Xylella fastidiosa is een Gram-negatieve non-gegeseld, pathogene bacterie die een aantal economisch belangrijke gewassen ziekten, waaronder de ziekte van Pierce in wijnstok (Vitis vinifera L.) 1,2, 3 veroorzaakt. Deze bacterie is beperkt tot de watervoerende xyleem vaartuigen. Infectie van grapevine zorgt ervoor dat de blokkade van de houtvaten en resulteert in het water stress en voedingstekorten 3. Succesvolle kolonisatie is afhankelijk van het vermogen van de bacterie om van de oorspronkelijke plaats van infectie aan de rest van de plant 3. Spiertrekkingen beweeglijkheid is een middel om flagellaire-onafhankelijke bacteriële beweging door de uitbreiding, gehechtheid, en intrekken van de polaire type IV pili 4 die gekenmerkt is in X. fastidiosa 5,6,7.

De spiertrekkingen beweeglijkheid is waargenomen door laser pincet en atomic force microscopie (AFM) 8,9,10. Met behulp van deze technieken, tbeheksen motilities gegenereerd door type IV pilus van N. gonorrhoeae jp P. aeruginosa werden gekenmerkt door fl uorescently etikettering pili en het vastleggen van hun bewegingen microscopisch. Hoewel beide methoden de kleefkracht van individuele bacteriën beschreven, de procedures ingewikkeld en tijdrovend 9,10. De micro fl uidic kamers werden gebruikt voor lange afstand migratie van afzonderlijke cellen en kleine aggregaten van bacteriecellen 5,6 waarnemen. Deze kamers zijn ontworpen als een microfabricated-nano-kanaal in een plaat geïntegreerd met een time-lapse beeldopname systeem 11,12,13,14. Micro fl uidic kamer apparaten bieden verschillende voordelen voor het bestuderen van verplaatsingsgedrag en cel-cel interacties bacteriën: (i) biedt een geïntegreerd platform meerkanaals vermogens; (Ii) het kan de bewegingen en combinaties van enkele cellen in de nano-schaal kenmerken van bacteriën te onderzoeken; (Iii) het zorgt voor directe microscopic beeldopname van bacteriële cellen en time-lapse analyse, (iv) indien langdurig ruimtelijke en temporele waarnemingen van afzonderlijke en / of populaties van bacteriën in een micro-omgeving; (V) de stroomsnelheid van kweekmedium in een kanaal kan nauwkeurig worden geregeld en (vi) in een zeer klein volume (1 ml) kweekmedium vereist voor elk experiment.

Onlangs heeft de micro fl uidic stroming systeem toegepast om het gedrag van bacteriële cellen onder verschillende micro-omgevingen 14,15,16 onderzoeken. De hechting en de bevestigingsoppervlak E. coli 15 X. fastidiosa 16 jp Acidovorax citrulli 14 tot glasoppervlakken werden beoordeeld met behulp van micro fl uidic kamers. De vorming aggregatie en bio fi lm gemedieerd door type IV pili van Acidovorax citrulli werden geanalyseerd 14. Bovendien is de beweging van A. citrulli waargenomen onder fl ow caarden aangetoond dat de type IV pili een belangrijke rol kunnen spelen in de kolonisatie en de verspreiding van A. citrulli in houtvaten onder sap fl ow omstandigheden. De spiertrekkingen motilities van Pseudomonas aeruginosa jp X. fastidiosa cellen werden met succes waargenomen tegen een vloeistof stroom in een microfabricated stromingskamer 5,6,17. Type IV pilus tekort pilB jp pilQ mutanten van X. fastidiosa bleken de snelheid van spiertrekkingen motiliteit onder stroming omstandigheden micro fl uidic apparaten 5,6,18 ingrijpend gewijzigd. De onderzoeken uitgevoerd op bacteriële hechting en beweeglijkheid in micro fl uidic apparaten aangegeven dat de micro fl uidic kamers zijn bijzonder geschikt voor het analyseren van de twitching beweeglijkheid en migratie van pili-gemedieerde bacteriën in vitro. Deze resultaten verklaren de-spiertrekkingen gemedieerde migratie mechanisme dat cel-cel hechting, aggregatie en kolonisatie binnen faciliteertde gastheer, uiteindelijk leiden tot een systemische infectie.

Pil-Chp operon van X. fastidiosa bevat pilG, Pili, pilJ, pil, chpB jp WKKC die coderen voor signaaltransductie 20. De transmembraan chemoreceptors binden chemische stimuli in de periplasmatische domein en activeert een signalerende cascade in hun cytoplasma deel om uiteindelijk onder controle bacteriële trillen beweeglijkheid. In de Pil-Chp operon van X. fastidiosa, een fosfo-shuttle eiwit PilG is een homoloog te CheY. In E. coli jp P. aeruginosa, CheY is het antwoord regulator in chemotaxis systemen die interageren met de flagella motor-eiwitten 19, 21. Hoewel de bijdragen van de Pil-Chp operon in de richting van virulentie in X. fastidiosa zijn onlangs onderzocht 20, de rol van pilG in chemotaxis operon in reactie op de signalen uit de omgeving en gereguleerd / motor type IV pili X. fastidiosa is uncLear. Het inzicht van chemotaxis regulator pilG verhelderen de activiteit van twitching beweeglijkheid van X. fastidiosa, is een micro fl uidic kamer gebruikt om het trillen beweeglijkheid van X. beoordelen fastidiosa. De pilG van X. fastidiosa wordt gekenmerkt door het vergelijken van de fenotypes van een deletie mutant Xf ΔpliG, complementaire stam XfΔpliG -C en de wild-type in vitro. De resultaten benadrukken de rol van pilG in het trillen beweeglijkheid van X. fastidiosa.

Protocol

1. De Peripheral Fringe van Bacteriële Colony Grow X. fastidiosa (Xf) Temecula wildtype 22, pilG deletiemutant Xf ΔpliG (middels eerder beschreven deletie strategie 23), en de aanvullende XfΔpliG -C (middels eerder beschreven chromosoom gebaseerde genetische complementatie strategie 24) op PD2 medium agarplaten 25 bij 28 ° C gedurende 5-7 dagen. Autoclaaf cellofaan (1 x 1 cm 2) in water b…

Representative Results

De aanwezigheid van een perifere rand kolonie indicatief type IV pilus-gemedieerde twitching beweeglijkheid, werd waargenomen in de kolonies van X. fastidiosa wildtype en complementaire Xf ΔpliG -C stam (figuur 1). Mutant XfΔpliG echter vertoonden geen franjes rond de omtrek van de kolonies (figuur 1). Time-lapse beeldvorming van bacteriële cellen in nano-microfluïdische stroom kamers bleek dat spiertrekkingen bewe…

Discussion

In deze studie hebben we karakteriseerde de beweging gedrag van X. fastidiosa PilG mutant Xf ΔpilG en zijn complementaire XfΔpilG- C-stammen in nieuw ontworpen meerdere parallelle-nano-kanaals micro fl uidic kamers. De nieuw ontworpen micro fl uidic kamers kunnen maximaal vier parallelle kamers met 100 micrometer nano-kanaal in de breedte ten opzichte van eerdere modellen met slechts een enkele 50 micrometer breed kanaal 18. De verbeterde brede nano-kanaal vergem…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Deze studie werd ondersteund door de United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service. Handelsnamen of commerciële producten in deze publicatie zijn uitsluitend genoemd voor het verstrekken van specifieke informatie en impliceert niet aanbeveling of goedkeuring door het Amerikaanse ministerie van Landbouw. USDA is een gelijke kans provider en werkgever.

Materials

Biology materials
X. fastidiosa (Xf) Temecula wild type Costa, H. S., et al., 2004 22
pilG deletion mutant XfΔpliG Shi, X. Y., et al., 2007 26
pilG complementary strain XfΔpliG-C  Davis, M. J., wt al. 1998 23
Physical materials and equipment
Disposable inoculating loops VWR international, Radnor, PA #22-363-607 quantitative procedures such as bacterial collection
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning Corporation #0002709226 Sylgard 184 silicone Elastomeric Kits
AmScope MD2000 digital camera AmScope, Irvine, CA SE305R-AZ-E Image, video recording and measurement 
Tubes line Edgewood, NY #T4300 Connected to the syringe and microfluidic chamber
Plastic luer connectors Edgewood, NY Connected to the syringe and microfluidic chamber
Syringe pumps Pico Plus, Harvard Apparatus, MA #702209 The flow rate can be adjusted while the pump is running.
Syringes Gastight, Hemilton Company, Reno, NV #1005 Provide the flowing broth
Inverted Olympus IMT-2 microscope Olympus IMT-2 FLuoro PHase Image observation and recording
SPOT-RT digital camera Diagnostic Instruments, Inc., MI RT230 Image, video recording and measurement
Microscope Shutter The UNIBLITZ, US #LS2T2 Control camera’s exposure time
Microscope Shutter Control system The UNIBLITZ, US VCM-D1 VCM-D1 Single Channel CE/UL/CSA Approved Shutter Driver
MetaMorph Image software Universal Imaging Corp., PA Real-time super-resolution image processing 

参考文献

  1. Purcell, A. H., Hopkins, D. L. Fastidious xylem-limited bacterial plant pathogens. Annu. Rev. Phytopathol. 34, 131-151 (1996).
  2. Purcell, A. H. Xylella fastidiosa, a regional problem or global threat. J. Plant Pathology. 79, 99-105 (1997).
  3. Hopkins, D. L. Xylella fastidiosa: Xylem-limited bacterial pathogen of plants. Annu. Rev. Phytopathol. 27, 271-290 (1989).
  4. Mattick, J. S. Type IV pili and twitching motility. Annu. Rev. Microbiol. 56, 289-314 (2002).
  5. Meng, Y., et al. Upstream migration of Xylella fastidiosa via pilus-driven twitching motility. J. Bacteriol. 187, 5560-5567 (2005).
  6. Li, Y., et al. Type I and type IV pili of Xylella fastidiosa affect twitching motility, biofilm formation and cell-cell aggregation. 微生物学. 153, 719-726 (2007).
  7. Simpson, A. J. G., et al. The genome sequence of the plant pathogen Xylella fastidiosa. Nature. 406, 151-157 (2000).
  8. Maier, B., Potter, L., So, M., Long, C. D., Seifert, H. S., Sheetz, M. P. Single pilus motor forces exceed 100 pN. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 16012-16017 (2002).
  9. Touhami, A., Jericho, M. H., Boyd, J. M., Beveridge, T. J. Nanoscale characterization and determination of adhesion forces of Pseudomonas aeruginosa pili by using atomic force microscopy. J. Bacteriol. 188, 370-377 (2006).
  10. Skerker, J. M., Berg, H. C. Direct observation of extension and retraction of type IV pili. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 6901-6904 (2001).
  11. Brown, D. C., Larson, R. S. Improvements to parallel plate flow chambers to reduce reagent and cellular requirements. BMC Immunol. 2, 9 (2001).
  12. Thomas, W. E., Nilsson, L. M., Forero, M., Sokurenko, E. V., Vogel, V. Shear-dependent ‘stick-and-roll’ adhesion of type 1 fimbriated Escherichia coli. Mol. Microbiol. 53, 1545-1557 (2004).
  13. Thomas, W. E., Trintchina, E., Forero, M., Vogel, V., Sokurenko, E. V. Bacterial adhesion to target cells enhanced by shear force. Cell. 109, 913-923 (2002).
  14. Bahar, O., Fuente, D. L., Burdman, S. Assessing adhesion, biofilm formation and motility of Acidovorax citrulli using microfluidic flow chambers. FEMS Microbiol. Lett. 312, 33-39 (2010).
  15. Thomas, W. E. Using a laminar flow system to explain shear-enhanced bacterial adhesion. Proceedings of ICMM2005, Third International Conference on Microchannels and Mini-channels. , 751-759 (2005).
  16. Fuente, D. L., et al. Assessing adhesion forces of type I and type IV pili of Xylella fastidiosa bacteria by use of a microfluidic flow chamber. Appl. Environ. Microbiol. 73, 2690-2696 (2007).
  17. DeLange, P. A., Collins, T. L., Pierce, G. E., Robinson, J. B. PilJ localizes to cell poles and is required for type IV pilus extension in Pseudomonas aeruginosa. Curr Microbiol. 55, 389-395 (2007).
  18. Fuente, D. L., Burr, T. J., Hoch, H. C. Mutations in type I and type IV pilus biosynthetic genes affect twitching motility rates in Xylella fastidiosa. J. Bacteriol. 189, 7507-7510 (2007).
  19. Ferandez, A., Hawkins, A. C., Summerfield, D. T., Harwood, C. S. Cluster II che genes from Pseudomonas aeruginosa are required for an optimal chemotactic response. J. Bacteriol. 184, 4374-4383 (2002).
  20. Cursino, L., et al. Identification of an Operon, Pil-Chp, That Controls Twitching Motility and Virulence in Xylella fastidiosa. Mol. Plant Microbe Interact. 10, 1198-1206 (2011).
  21. Hazelbauer, G. L., Falke, J. J., Parkinson, J. S. Bacterial chemoreceptors: High-performance signaling in networked arrays. Trends Biochem. Sci. 33, 9-19 (2008).
  22. Costa, H. S., et al. Plant hosts of Xylella fastidiosa in and near southern California vineyards. Plant Dis. 88, 1255-1261 (2004).
  23. Shi, X. Y., Dumenyo, C. K., Hernandez-Martinez, R., Azad, H., Cooksey, D. A. Characterization of regulatory pathways in Xylella fastidiosa: genes and phenotypes controlled by algU. Appl. Environ. Microbiol. 73, 6748-6756 (2007).
  24. Matsumoto, A., Young, G. M., Igo, M. M. Chromosome-Based Genetic Complementation System for Xylella fastidiosa. Appl. Environ. Microbiol. 75, 1679-1687 (2009).
  25. Davis, M. J., Purcell, A. H., Thomson, S. V. Isolation Media for the Pierce’s Disease Bacterium. Phytopathology. 70, 425-429 (1980).
  26. Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography. Annu. Rev. Mater. Sci. 28, 153-184 (1998).
  27. Chaudhury, M. K., Whitesides, G. M. Direct measurement of interfacial interactions between semispherical lenses and flat sheets of poly-(dimethylsiloxane) and their chemical derivatives. Langmuir. 7, 1013-1025 (1991).
  28. Cruz, L. F., Parker, J. K., Cobine, P. A., De La Fuente, L. Calcium-enhanced twitching motility in Xylella fastidiosa is linked to a single PilY1 homolog. Appl. Environ. Microbiol. 80, 7176-7196 (2014).

Play Video

記事を引用
Shi, X., Lin, H. Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilGXylella fastidiosa. J. Vis. Exp. (110), e53816, doi:10.3791/53816 (2016).

View Video