التصور من الوخز على الحركة وتوصيف دور<em> PilG</em> في<em> Xylella fastidiosa</em
概要
في هذه الدراسة، كان يعمل في غرفة تدفق نانو ميكروفلويديك لتصور وظيفيا تميز الحركة ارتعاش Xylella fastidiosa، وهي البكتيريا التي تسبب مرض بيرس في الكرمة.
Abstract
Xylella fastidiosa هو نوع من البكتيريا سالبة الجرام غير سوطي التي تسبب عددا من الأمراض الهامة اقتصاديا من النباتات. تقدم الحركة الوخز اكس. fastidiosa وسيلة للحركة لمسافات طويلة داخل المصنع والاستعمار، إذ تسهم نحو المرضية في اكس. fastidiosa. إن الحركة ارتعاش اكس. يتم تشغيل fastidiosa من النوع الرابع الشعرة. وينظم النوع الرابع الشعرة من Xylella fastidiosa التي كتبها pilG، منظم الكيميائي في بيل-حزب الشعب الجمهوري البروتينات ترميز الاوبرون التي تشارك مع مسارات نقل الإشارة. لتوضيح أدوار pilG في الحركة ارتعاش اكس. وقد وضعت fastidiosa، وpilG -deficient متحولة XF ΔpilG وسلالة مكملة لها XfΔpilG- C التي تحتوي على pilG مواطن. واستخدمت غرف ميكروفلويديك متكاملة مع نظام تسجيل صورة مرور الزمن لمراقبة الوخز الحركة في XfΔpILG، XfΔpilG- C ونوع السلالة في البرية. باستخدام هذا النظام تسجيل، فإنه يسمح الملاحظات على المدى الطويل المكانية والزمانية لتجميع والهجرة من الخلايا الفردية والسكان من البكتيريا عبر حركية الوخز. اكس. أظهر fastidiosa النوع البري ومكملة XfΔpilG- C سلالة خصائص الوخز حركية نموذجية الملاحظة المباشرة في غرف تدفق الموائع الدقيقة، في حين عرضت متحولة XfΔpliG النمط الظاهري نقص الوخز. وتوضح هذه الدراسة أن pilG يساهم في الحركة ارتعاش اكس. fastidiosa. ويستخدم غرفة تدفق الموائع الدقيقة كوسيلة لمراقبة الوخز حركية.
Introduction
Xylella fastidiosa هو غير سوطي، البكتيريا المسببة للأمراض سلبية الغرام التي تسبب عددا من الأمراض المحاصيل ذات الأهمية الاقتصادية، بما في ذلك مرض بيرس في الكرمة (كرمة العنب الاوروبي L.) 1،2، 3. هذه البكتيريا يقتصر على الخشب التي تضطلع المياه أوعية. إصابة الكرمة يتسبب في انسداد الأوعية الخشب والنتائج في الإجهاد المائي ونقص التغذية 3. الاستعمار الناجح يعتمد على قدرة بكتيريا للانتقال من موقع الأولي العدوى إلى بقية النبات 3. الوخز حركية وسيلة لحركة البكتيرية مستقلة سوطي من خلال الإرشاد، والمرفق، وتراجع من نوع القطبي الرابع البيلي 4 التي اتسمت في اكس. fastidiosa 5،6،7.
وقد لوحظ أن الحركة الوخز بواسطة ملاقط الليزر ومجهر القوة الذرية (AFM) 8،9،10. باستخدام هذه التقنيات، رmotilities السحر ولدت من النوع الرابع شعرة من N. السيلان و P. تميزت الزنجارية التي كتبها فلوريدا uorescently وضع العلامات البيلي والاستيلاء على تحركاتهم مجهريا. على الرغم من أن كلتا الطريقتين قد فصلت قوة لاصقة من البكتيريا الفردية، وإجراءات معقدة وتستغرق وقتا طويلا 9،10. استخدمت الدوائر uidic فلوريدا الصغيرة لمراقبة الهجرة لمسافات طويلة من الخلايا الفردية، وكذلك مجاميع صغيرة من الخلايا البكتيرية 5،6. وقد صممت هذه الغرف باعتبارها نانو قناة microfabricated في لوحة متكاملة مع الوقت الفاصل بين نظام تسجيل صورة 11،12،13،14. فلوريدا مايكرو الأجهزة غرفة uidic توفر مزايا عدة لدراسة السلوك الحركي وخلية خلية التفاعلات من البكتيريا: (ط) أنه يوفر منصة متكاملة مع قدرات قناة متعددة؛ (ب) فإنه يمكن دراسة الاقتراحات وتجمعات من الخلايا وحيدة في ملامح نانو النطاق من البكتيريا. (ج) لأنها تتيح م مباشرicroscopic تسجيل صورة من الخلايا البكتيرية وتحليل الوقت الفاصل، (د) ويوفر الملاحظات المكانية والزمانية على المدى الطويل من سكان الفردية و / أو من البكتيريا في بيئة الصغرى؛ (ت) معدل التدفق من مستنبت في قناة يمكن التحكم بدقة ومطلوب (السادس) فقط حجم صغير جدا (1 مل) من مستنبت لكل تجربة.
في الآونة الأخيرة، وقد تم توظيف الجزئي فلوريدا uidic آه فلوريدا نظام للتحقيق في سلوك الخلايا البكتيرية في إطار مختلف microenvironments 14،15،16. والإلتصاق والمرفق سطح E. القولونية 15، X. fastidiosa 16، وAcidovorax citrulli 14 إلى الواجهات الزجاجية وتقييمها باستخدام الصغير فلوريدا غرف uidic. وقد تم تحليل تشكيل تجميع وفاي الحيوي ل م بوساطة النوع الرابع الشعرة من Acidovorax citrulli 14. وعلاوة على ذلك، فإن الحركة من أ. لاحظ citrulli تحت آه فلوريدا جتظاهر onditions أن البيلي النوع الرابع قد تلعب أدوارا هامة في الاستعمار وانتشار A. citrulli في الأوعية الخشب تحت النسغ آه فلوريدا الظروف. وmotilities الوخز الزائفة الزنجارية وX. وقد لوحظت خلايا fastidiosa بنجاح ضد تيار السائل في غرفة تدفق microfabricated 5،6،17. نقص النوع الرابع شعرة pilB وpilQ المسوخ من X. تم العثور على fastidiosa إلى تغيير عميق في سرعة الوخز الحركة في ظل الظروف آه فلوريدا في الأجهزة uidic فلوريدا الصغيرة 5،6،18. وأشارت الدراسات التي أجريت على التصاق البكتيريا والحركة في الأجهزة uidic فلوريدا الصغرى أن الدوائر uidic الصغير فلوريدا هي مناسبة خاصة لتحليل حركية الوخز والهجرة من البكتيريا بوساطة البيلي في المختبر. تفسر هذه النتائج آلية الهجرة بوساطة الوخز مما يسهل التعلق خلية خلية، وتجميع والاستعمار فيالمضيف، تؤدي في النهاية إلى الإصابة النظامية.
بيل-حزب الشعب الجمهوري الاوبرون من X. fastidiosa يحتوي pilG، بيلي، pilJ، حبوب منع الحمل، chpB وchpC التي مسارات إشارة ترميز التنبيغ 20. والمستقبلات الكيميائية عبر الغشاء ربط المحفزات الكيميائية في نطاق محيط بالجبلة وتفعيل شلال يشير في جزء حشوية قدرتهم على السيطرة في نهاية المطاف البكتيرية حركية الوخز. في الاوبرون بيل-حزب الشعب الجمهوري من X. fastidiosa، وهو بروتين PilG الفوسفات المكوك هو نديد لCHEY. في E. القولونية و P. الزنجارية، CHEY هو منظم استجابة في أنظمة الكيميائي التي تتفاعل مع بروتينات سياط محرك 19 و 21. على الرغم من أن مساهمات الاوبرون بيل-حزب الشعب الجمهوري نحو الفوعة في اكس. تم فحص fastidiosa مؤخرا 20، ودور pilG في الاوبرون الكيميائي في استجابة لإشارات البيئية وتنظيم / المحرك النوع الرابع الشعرة من X. fastidiosa هو UNCلير. لتوضيح فكرة الكيميائي منظم pilG في نشاط الحركة ارتعاش اكس. fastidiosa، يتم استخدام غرفة uidic فلوريدا متناهية الصغر لتقييم الحركة ارتعاش اكس. fastidiosa. يتميز pilG من اكس fastidiosa بمقارنة الظواهر من المسخ حذف XF ΔpliG، سلالة مكملة XfΔpliG -C والنوع البري في المختبر. تسلط هذه النتائج الضوء على دور pilG في الحركة ارتعاش اكس. fastidiosa.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه الدراسة، ونحن ميزت سلوك حركة اكس. fastidiosa PilG متحولة XF ΔpilG ومتكاملة سلالات XfΔpilG- C في المصممة حديثا متعددة متوازية نانو قناة الصغرى غرف uidic فلوريدا. لا تستطيع الدوائر uidic المصممة حديثا الصغير فلوريدا قد تصل إلى أربع قاعات متوازية مع 100 ميكرو?…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذه الدراسة من قبل الولايات المتحدة وزارة الزراعة، دائرة البحوث الزراعية. وذكر الأسماء التجارية أو المنتجات التجارية في هذا المنشور فقط لغرض توفير معلومات محددة، ولا تعني توصية أو تأييد من قبل وزارة الزراعة في الولايات المتحدة. وزارة الزراعة الأميركية تساوي مزود الفرصة وصاحب العمل.
Materials
| Biology materials | |||
| X. fastidiosa (Xf) Temecula wild type | Costa, H. S., et al., 2004 22 | ||
| pilG deletion mutant XfΔpliG | Shi, X. Y., et al., 2007 26 | ||
| pilG complementary strain XfΔpliG-C | Davis, M. J., wt al. 1998 23 | ||
| Physical materials and equipment | |||
| Disposable inoculating loops | VWR international, Radnor, PA | #22-363-607 | quantitative procedures such as bacterial collection |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning Corporation | #0002709226 | Sylgard 184 silicone Elastomeric Kits |
| AmScope MD2000 digital camera | AmScope, Irvine, CA | SE305R-AZ-E | Image, video recording and measurement |
| Tubes line | Edgewood, NY | #T4300 | Connected to the syringe and microfluidic chamber |
| Plastic luer connectors | Edgewood, NY | Connected to the syringe and microfluidic chamber | |
| Syringe pumps | Pico Plus, Harvard Apparatus, MA | #702209 | The flow rate can be adjusted while the pump is running. |
| Syringes | Gastight, Hemilton Company, Reno, NV | #1005 | Provide the flowing broth |
| Inverted Olympus IMT-2 microscope | Olympus | IMT-2 FLuoro PHase | Image observation and recording |
| SPOT-RT digital camera | Diagnostic Instruments, Inc., MI | RT230 | Image, video recording and measurement |
| Microscope Shutter | The UNIBLITZ, US | #LS2T2 | Control camera’s exposure time |
| Microscope Shutter Control system | The UNIBLITZ, US | VCM-D1 | VCM-D1 Single Channel CE/UL/CSA Approved Shutter Driver |
| MetaMorph Image software | Universal Imaging Corp., PA | Real-time super-resolution image processing |
参考文献
- Purcell, A. H., Hopkins, D. L. Fastidious xylem-limited bacterial plant pathogens. Annu. Rev. Phytopathol. 34, 131-151 (1996).
- Purcell, A. H. Xylella fastidiosa, a regional problem or global threat. J. Plant Pathology. 79, 99-105 (1997).
- Hopkins, D. L. Xylella fastidiosa: Xylem-limited bacterial pathogen of plants. Annu. Rev. Phytopathol. 27, 271-290 (1989).
- Mattick, J. S. Type IV pili and twitching motility. Annu. Rev. Microbiol. 56, 289-314 (2002).
- Meng, Y., et al. Upstream migration of Xylella fastidiosa via pilus-driven twitching motility. J. Bacteriol. 187, 5560-5567 (2005).
- Li, Y., et al. Type I and type IV pili of Xylella fastidiosa affect twitching motility, biofilm formation and cell-cell aggregation. 微生物学. 153, 719-726 (2007).
- Simpson, A. J. G., et al. The genome sequence of the plant pathogen Xylella fastidiosa. Nature. 406, 151-157 (2000).
- Maier, B., Potter, L., So, M., Long, C. D., Seifert, H. S., Sheetz, M. P. Single pilus motor forces exceed 100 pN. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 16012-16017 (2002).
- Touhami, A., Jericho, M. H., Boyd, J. M., Beveridge, T. J. Nanoscale characterization and determination of adhesion forces of Pseudomonas aeruginosa pili by using atomic force microscopy. J. Bacteriol. 188, 370-377 (2006).
- Skerker, J. M., Berg, H. C. Direct observation of extension and retraction of type IV pili. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 6901-6904 (2001).
- Brown, D. C., Larson, R. S. Improvements to parallel plate flow chambers to reduce reagent and cellular requirements. BMC Immunol. 2, 9 (2001).
- Thomas, W. E., Nilsson, L. M., Forero, M., Sokurenko, E. V., Vogel, V. Shear-dependent ‘stick-and-roll’ adhesion of type 1 fimbriated Escherichia coli. Mol. Microbiol. 53, 1545-1557 (2004).
- Thomas, W. E., Trintchina, E., Forero, M., Vogel, V., Sokurenko, E. V. Bacterial adhesion to target cells enhanced by shear force. Cell. 109, 913-923 (2002).
- Bahar, O., Fuente, D. L., Burdman, S. Assessing adhesion, biofilm formation and motility of Acidovorax citrulli using microfluidic flow chambers. FEMS Microbiol. Lett. 312, 33-39 (2010).
- Thomas, W. E. Using a laminar flow system to explain shear-enhanced bacterial adhesion. Proceedings of ICMM2005, Third International Conference on Microchannels and Mini-channels. , 751-759 (2005).
- Fuente, D. L., et al. Assessing adhesion forces of type I and type IV pili of Xylella fastidiosa bacteria by use of a microfluidic flow chamber. Appl. Environ. Microbiol. 73, 2690-2696 (2007).
- DeLange, P. A., Collins, T. L., Pierce, G. E., Robinson, J. B. PilJ localizes to cell poles and is required for type IV pilus extension in Pseudomonas aeruginosa. Curr Microbiol. 55, 389-395 (2007).
- Fuente, D. L., Burr, T. J., Hoch, H. C. Mutations in type I and type IV pilus biosynthetic genes affect twitching motility rates in Xylella fastidiosa. J. Bacteriol. 189, 7507-7510 (2007).
- Ferandez, A., Hawkins, A. C., Summerfield, D. T., Harwood, C. S. Cluster II che genes from Pseudomonas aeruginosa are required for an optimal chemotactic response. J. Bacteriol. 184, 4374-4383 (2002).
- Cursino, L., et al. Identification of an Operon, Pil-Chp, That Controls Twitching Motility and Virulence in Xylella fastidiosa. Mol. Plant Microbe Interact. 10, 1198-1206 (2011).
- Hazelbauer, G. L., Falke, J. J., Parkinson, J. S. Bacterial chemoreceptors: High-performance signaling in networked arrays. Trends Biochem. Sci. 33, 9-19 (2008).
- Costa, H. S., et al. Plant hosts of Xylella fastidiosa in and near southern California vineyards. Plant Dis. 88, 1255-1261 (2004).
- Shi, X. Y., Dumenyo, C. K., Hernandez-Martinez, R., Azad, H., Cooksey, D. A. Characterization of regulatory pathways in Xylella fastidiosa: genes and phenotypes controlled by algU. Appl. Environ. Microbiol. 73, 6748-6756 (2007).
- Matsumoto, A., Young, G. M., Igo, M. M. Chromosome-Based Genetic Complementation System for Xylella fastidiosa. Appl. Environ. Microbiol. 75, 1679-1687 (2009).
- Davis, M. J., Purcell, A. H., Thomson, S. V. Isolation Media for the Pierce’s Disease Bacterium. Phytopathology. 70, 425-429 (1980).
- Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography. Annu. Rev. Mater. Sci. 28, 153-184 (1998).
- Chaudhury, M. K., Whitesides, G. M. Direct measurement of interfacial interactions between semispherical lenses and flat sheets of poly-(dimethylsiloxane) and their chemical derivatives. Langmuir. 7, 1013-1025 (1991).
- Cruz, L. F., Parker, J. K., Cobine, P. A., De La Fuente, L. Calcium-enhanced twitching motility in Xylella fastidiosa is linked to a single PilY1 homolog. Appl. Environ. Microbiol. 80, 7176-7196 (2014).
