A microfabricated device with sealable femtoliter-volume reaction chambers is described. This report includes a protocol for sealing cell-free protein synthesis reactants inside these chambers for the purpose of understanding the role of crowding and confinement in gene expression.
Sistemi cell-free forniscono una piattaforma flessibile per sondare le reti specifiche di reazioni biologiche isolate dalla condivisione delle risorse complesso (ad esempio, l'espressione genica globale, la divisione cellulare) incontra all'interno di cellule viventi. Tuttavia, tali sistemi, utilizzati in macro-scala reattori massa tradizionali, spesso non riescono a mostrare i comportamenti dinamici e le efficienze caratteristici delle loro controparti micro-scala di vita. Capire l'impatto della struttura cellulare interna e la scala sulla dinamica di reazione è cruciale per comprendere reti geniche complesse. Qui riportiamo un dispositivo microfabbricazione che limita le reazioni cell-free dei volumi scala cellulare, consentendo caratterizzazione flessibile del sistema molecolare chiuso. Questo poli multistrato (dimetilsilossano) (PDMS) dispositivo contiene camere di reazione femtoliter dimensioni su una membrana elastomerica azionabile (aperto e chiuso). Quando azionato, le camere di confinare proteine della cellula-Free Sintesi (CFPS) reazioniesprimendo una proteina fluorescente, permettendo la visualizzazione della cinetica di reazione nel tempo utilizzando la microscopia a fluorescenza time-lapse. Qui mostriamo come tale dispositivo può essere utilizzato per misurare la struttura di rumore di reazioni CFPS in un modo che è direttamente analogo a quelli utilizzati per caratterizzare sistemi cellulari, consentendo così l'impiego di tecniche di biologia rumore utilizzate in sistemi cellulari di caratterizzare circuiti gene CFPS e loro interazioni con l'ambiente privo di cellule.
Sistemi cell-free offrono una piattaforma semplificata e flessibile per la visualizzazione di reazioni biologiche privo di fattori di complicazione, come il fitness, la divisione, e mutazione che sono inevitabili nello studio delle cellule viventi. Tali approcci sono stati impiegati per studiare sistemi cellulari compresa la caratterizzazione delle proteine di membrana 1, l'ispezione delle interazioni proteina 2, e l'esplorazione degli aspetti fondamentali della traduzione 3-7. Recentemente sistemi cell-free hanno cominciato a prendere piede come piattaforme praticabili per la biologia sintetica 8-10. L'appello di questi approcci è che liberano biologia sintetica dalla condivisione delle risorse e 'il rumore estrinseco' che colpisce dinamica di reazione nelle cellule viventi. Tuttavia non è ancora chiaro come l'ambiente fisico in cui le reazioni cell-free sono incorporati influenza la progressione e l'esito della reazione. Ambienti di reazione senza cellulare – biente particolarmente limitatiEnt che si avvicinano volumi cellule rilevanti – rimangono poco caratterizzati. Protein Cell-libero Synthesis (CFPS) è convenzionalmente pensiero di come 'gratuito scala,' esibendo cinetica equivalenti in tutta una serie di microlitri per volumi di reazione litro scala 11. Tuttavia, confinanti reazioni a volumi scala cellulare ha dimostrato di influenzare in modo significativo i tassi di espressione proteica 12.
La natura stocastica di reazioni cell-free – soprattutto in quanto questi approccio di sistema o anche andare sotto femtoliter volumi – possono essere di particolare importanza. Rumore in espressione genica è una struttura fortemente influenzato dal confinamento come piccoli volumi cellulari e alta densità di componenti forzare molte delle molecole importanti da livelli molto bassi di popolazione – per esempio Escherichia coli confini all'interno di un volume 1 fl ben 4.300 differenti polipeptidi sotto il controllo inducibile di diverse centinaia di diversi promotori 13. Questo rumore intrinseco è stato implicato come una forza trainante centrale in numerosi processi biologici, tra cui chemiotassi 14, la decisione di HIV tra la replicazione attiva e la latenza 15, la decisione di λ fago tra lisi e lisogenia 16,17, e la decisione di Bacillus subtillus tra competenza e sporulazione 17. Senza cellulare biologia sintetica fornisce quindi sia la possibilità di esplorare le proprietà stocastiche dei circuiti genici cellulari e reti, e manipolare questi comportamenti per raggiungere obiettivi tecnologici specifici. Mentre il comportamento di rumore dei sistemi cellulari è stato ben studiato 18-27, c'è stato poco esplorazione del comportamento acustico fondamentale dei sistemi acellulari 8, in particolare a livello cellulare.
Qui vi presentiamo una piattaforma per lo studio degli effetti stocastici in cell-free biologia sintetica. Questa piattaforma microfabbricazione contiene femtoliter scala reazione cHambers che possono essere rapidamente la transizione tra aperto (libera diffusione in e fuori dalla camera) e chiusi (reagenti confinati all'interno della camera) stati. Nello stato di chiusura, ci limitiamo cellule-Free sintesi proteica (CFPS) reagenti che esprimono una proteina fluorescente verde (GFP), e seguiamo espressione genica utilizzando time-lapse microscopia a fluorescenza 28 (Figura 1). Abbiamo caratterizzare questo ambiente privo di cellule misurando la struttura delle fluttuazioni stocastiche nell'espressione genica in modo direttamente analogo a quelli utilizzati per caratterizzare cellule 25. Metodi non microfabbricazione per confinare reazioni cell-free sono vescicole e liposomi 29-32, emulsioni acqua in olio, 12 e 33 mezzi porosi. Tuttavia, mentre questi metodi possono fornire un controllo sulla distribuzione delle dimensioni dei volumi confinati 34, metodi di microfabbricazione creano caratteristiche altamente riproducibili con dimensioni strettamente specificate, anche su scala nanometrica.Inoltre, queste strutture rigide possono essere facilmente monitorati nel tempo senza essere suscettibile di evaporazione o cambiamenti nell'ambiente esterno. Disegni container microfabbricati utilizzati nel precedente 8,35 lavoro non può sigillare rapidamente le camere di reazione seguente reazione iniziazione, complicando la chiara attribuzione del tempo in cui è stata avviata la reazione (tempo zero). Utilizzando il metodo qui presentato, solo 4-5 min sono necessari tra l'inizio e la visualizzazione della reazione sul dispositivo, fornendo così una ben definita "tempo zero". I seguenti protocolli descrivono i metodi di fabbricazione e collaudo di questo dispositivo, compresa la litografia ottica, il montaggio del dispositivo, il test del dispositivo, e metodi per l'analisi delle immagini.
L'espressione genica nelle cellule è intrinsecamente rumorosa a causa di piccoli volumi cellulari e basso numero di copie di reagenti importanti. Biologia rumore spesso si concentra sulle fonti, la lavorazione, e le conseguenze biologiche delle fluttuazioni delle popolazioni, concentrazioni, posizioni, o stati di molecole che controllano i circuiti e le reti di 44 geni. La maggior parte di questo lavoro è stata eseguita in sistemi cellulari, che ha il vantaggio di vedere il rumore di un circuito di gene nel contesto naturale delle reti genetiche all'interno della cellula. Tuttavia, i sistemi acellulari permettono la caratterizzazione delle fluttuazioni intrinseche di un circuito singolo gene senza gli effetti estrinseci confondenti 18 che non possono essere evitati in sistemi cellulari. Analisi del rumore può offrire importanti spunti fisici in modo genetica circuiti sono strutturati e il loro funzionamento, ed è stato utilizzato in sistemi cellulari di caratterizzare negative 25 e positivo <sup> 27 autoregolazione, estrinseci ed intrinseci contributi al rumore espressione 18, e trascrizionale di rottura 45,46. Qui si descrive lo studio di un sistema di espressione di cellule in dispositivi microfluidici che consentono il controllo simultaneo di dimensioni del reattore e la reazione iniziazione volte, al fine di comprendere meglio il ruolo che parto e spiazzamento 47,48 hanno sulla intrinseca rumore espressione della proteina senza complicazioni associate con le cellule viventi.
La chiave che permette caratteristica del progetto è l'integrazione di array di femtoliter volume (micron scala) camere di reazione utilizzati per confinare i reagenti di un sistema di espressione proteica cell-free, con una membrana elastomerica "valvola di controllo" in PDMS che intrappola il reagenti in un ben definito, "tempo zero" per reazione apertura (figura 1). Questo controllo permette la cinetica delle reazioni coinvolte nella sintesi proteica da FOLLdovuto in tempo reale ad alta precisione. Come tale, è importante gestire reagenti privi di cellule in modo che la variabilità inter-sperimentale è minimizzato il più possibile. Questo controllo permette di valutare la struttura di rumore dei circuiti genetici privi di cellule in un modo che è analogo a tecniche precedentemente usati per valutare l'espressione genica nelle cellule viventi.
Come reagenti usati nei sistemi CFPS possono essere sensibili al gelo-disgelo, è importante mantenere i reagenti freddi e minimizzare il tempo di reagenti trascorrono scongelamento su ghiaccio. È buona norma verificare periodicamente l'espressione del sistema CFPS in massa per identificare cambiamenti nei livelli di espressione nel tempo – ciò può essere fatto in una reazione di 10-15 ml in un tubo Eppendorf, o in un dispositivo come un lettore di micropiastre , che esegue più letture nel tempo per catturare cinetica di reazione. Notando i tempi di età e disgelo dei reagenti per ogni esperimento vi aiuterà durante la risoluzione bassa espressione lEvels. Inoltre, nel montaggio reagenti CFPS, è importante notare che la reazione inizia una volta che è completamente assemblato e rimosso dal ghiaccio. Per mantenere un "tempo zero" coerente, è utile per registrare il tempo dopo l'avvio della reazione CFPS dopo l'aggiunta finale del DNA di ingresso, e di applicare la reazione più rapidamente possibile al dispositivo incubate. Questo processo dovrebbe richiedere circa 4-5 minuti, e la fluorescenza non dovrebbe ancora essere visibile all'interno delle camere di reazione. Questo controllo assicura che il tempo disponibile per visualizzare la porzione di crescita della curva di reazione è massimizzata.
Prima di eseguire reazioni CFPS sul dispositivo, si consiglia di eseguire i test di controllo qualità per verificare non vi siano perdite dalle camere. Un test FRAP può essere eseguita (come nella Figura 2D) applicando un fluoroforo al dispositivo ed esponendo un pozzo individuo fino pozzo è completamente sbiancato. Se le camere sonoben sigillata,, nessun recupero dovrebbe essere visibile all'interno del pozzo – ci dovrebbe essere un netto contrasto tra le pareti del vano e gli spazi interni ed esterni. Se il recupero fluorescenza è evidente o le pareti della camera di reazione non sono ben definiti, la pressione sulla valvola di controllo deve essere aumentato o il dispositivo dovrebbe essere controllato per perdite o delaminazione dal vetrino.
Questo protocollo è stato testato con reagenti CFPS da E. commerciale Kit coli cell-free espressione della proteina (scala a 25 ml), anche se possono essere utilizzati altri sistemi robusti CFPS. È possibile utilizzare i volumi molto inferiore 25 microlitri nell'applicare reazioni al dispositivo, che può essere utile quando il costo reagente è un fattore limitante in esperimenti. Una volta reagenti vengono aggiunti al dispositivo e le camere di reazione sono sigillate, non è possibile aggiungere reagenti alla soluzione senza la valvola di controllo de-azionamento – quindi questo dispositivo non sia adattoLe reazioni che richiedono l'aggiunta di reagenti durante il corso della reazione. Questo dispositivo non è inoltre ottimizzato per osservare le reazioni CFPS che possono circolare più di 3 ore – gli effetti della disidratazione e l'essiccazione del dispositivo dopo questo periodo di tempo non sono state valutate. Se si desiderano tempi di reazione più lunghi, questi effetti possono essere mitigati sigillando il dispositivo per impedire l'evaporazione, cambiando la temperatura di incubazione, o utilizzando una camera umida. Le modifiche al progetto del dispositivo, come ad esempio le strutture nanoporose nelle pareti della camera di 49,50 o l'inserimento di uno strato di membrana porosa, rappresentano alcuni metodi che potrebbero consentire lo scambio dei reagenti e allungare tempi di reazione così.
Compartimenti di reazione microfabbricati volume uniforme sono utili per mantenere le dimensioni coerenti in tutta esperimenti e molto adatto per un'indagine "reazioni collaterali" con le pareti del vano. A differenza dei metodi che utilizzano notecniche di n-microfabbricati, queste reazioni devono essere valutati in piccole quantità, e non forniscono la flessibilità dimensionale durante gli esperimenti. Tuttavia, il disegno controllabile per queste camere di reazione è molto adatto per la microscopia time-lapse, e può essere un complemento illuminante ad un metodo ad alta velocità di confinamento.
The authors have nothing to disclose.
We thank Dr. Mitch Doktycz, Dr. Jennifer Morrel-Falvey, Dr. Amber Bible, and Dr. Brandon Razooky for helpful advice and conversations, and acknowledge Dr. Sukanya Iyer for constructing the Pet3a-EGFP plasmid used in the gene expression tests. We acknowledge support from the Center for Nanophase Materials Sciences, which is sponsored by the Scientific User Facilities Division, Office of Science, U.S. Department of Energy. SEN and PMC acknowledge support from Bredesen Center Fellowships at the University of Tennessee, Knoxville. This research was performed at Oak Ridge National Laboratory (ORNL). ORNL is managed by UT-Battelle, LLC, for the U.S. Department of Energy.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
SU-8 2015 | Microchem | SU-8 2000 series | Toxic. Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing. |
SU-8 Thinner | Microchem | SU-8 2000 series | Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing. |
SU-8 Developer | Microchem | SU-8 2000 series | Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing. |
Chlorotrimethylsilane | Sigma Aldrich | 92360 FLUKA | Hazardous. Corrosive to the respiratory tract., Reacts violently with water. |
Sylgard 184 PDMS | Dow Corning | SYLGARD 184 | |
0.75 mm hole-puncher | Ted Pella Inc. | 15072 | Harris Uni-Core |
23 ga needles blunt tip | Component Supply Co. | /NE-231PL-25 | |
#0 glass coverslip | Ted Pella Inc. | 260366 | Gold Seal |
Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | |
Microscope | Nikon Instruments | Eclipse TE 300 | |
CCD camera | Roper Scientific | CoolSNAP-HQ | |
Shutter | Shutter Insturment | Lambda SC | |
Light Source | Nikon | Intensilight C-HGFI | |
Color Filters | Chroma Technology Corp. | ZET 532/106 excitation, ZT 532rdc dichroic, ET 595/50m emission | |
100x oil-immersion objective | Nikon | N.A. 1.4 | |
Temperature Regulator | Oko Lab | H201-T | |
Metamorph | Universal Imaging Corp. | Version 7.8.3.0 | |
Marsh Bellofram transducers | Marsh Bellofram | T2000 | |
24 gauge PTFE tubing | Component Supply Co. | /SWTT-24-C | |
Septum vials | National Scientific | C4015- 17W | |
Power Supply | Hewlett Packard | 6205B Dual DC Power Supply | |
sharp 23 ga needles | Precision Glide | 305129 | |
Male-to-male luer lock adapters | Qosina | 20024 | Polycarbonate |
Stainless Steel Blunt Needle 23 Ga. | Component Supply Co. | /NE-232PL-5C | Polypropylene |
S30 E coli protein expression system | Promega | L1110 | |
Pet3a-GFP vector/protein | Novagen | 69418-3 | Assembled in-house. Inserted EGFP gene in Pet3a. |
Quantum Prep Plasmid Midiprep Kit | Biorad | #732-6120 | |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
Alexafluor 555 | Molecular Probes | AF555 | http://www.lifetechnologies.com |
ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | Version 1.46r | |
Plugin: Time Series Analyzer | Balaji J Dept. of Neurobiology, UCLA | Version 3.0 | |
Plugin: StackReg/TurboReg | Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne Biomedical Imaging Group | Distribution is dated July 7, 2011 | |
Plugin: ROI Manager Tools | Tiago Ferreira | 12/15/2013 Version |