A microfabricated device with sealable femtoliter-volume reaction chambers is described. This report includes a protocol for sealing cell-free protein synthesis reactants inside these chambers for the purpose of understanding the role of crowding and confinement in gene expression.
Celvrije systemen een flexibel platform voor aftasten netwerken van biologische reacties geïsoleerd uit het complex resource sharing (bijv globale genexpressie celdeling) aangetroffen in levende cellen. Echter, dergelijke systemen, gebruikt in conventionele macro-schaal bulk reactoren, vaak niet om het dynamische gedrag en efficiëntie kenmerk van hun levende micro-schaal tegenhangers vertonen. Inzicht in de gevolgen van de interne celstructuur en de schaal op de reactie dynamiek is van cruciaal belang voor het begrijpen van complexe gen-netwerken. Hier beschrijven we een microfabricated apparaat dat cel-vrij reacties opsluit in cellulaire schaal volumes terwijl flexibele karakterisering van de ingesloten moleculair systeem. Deze meerlaagse poly (dimethylsiloxaan) (PDMS) apparaat bevat femtoliter schaal reactiekamers op elastomeren membraan dat kan worden bediend (geopend en gesloten). Wanneer bediend, de kamers beperken Cell-allergene EiwitSynth (CFPS) reactiesexpressie van een fluorescerend eiwit, waardoor de visualisatie van de reactiekinetiek tijd met time-lapse fluorescentiemicroscopie. Hier laten we zien hoe dit apparaat kan worden gebruikt om het geluid structuur van CFPS reacties op een wijze die direct analoog aan die toegepast om cellulaire systemen karakteriseren, waarbij het gebruik van lawaai biologische technieken gebruikt in cellulaire systemen waarmee aan CFPS gen schakelingen karakteriseren meten en hun interacties met de celvrije omgeving.
Celvrije systemen bieden een eenvoudige en flexibel platform voor het bekijken biologische reacties vrij van complicerende factoren zoals fitness, delen en mutatie die onvermijdelijk de studie van levende cellen. Dergelijke benaderingen zijn gebruikt om cellulaire systemen waaronder de karakterisering van membraaneiwitten 1, het sonderen van eiwit interacties 2 en de verkenning van fundamentele aspecten van de vertaling 3-7 bestuderen. Onlangs cel-vrije systemen zijn begonnen om een voet aan de grond als levensvatbare platforms krijgen voor synthetische biologie 8-10. Het beroep van deze aanpak is dat ze vrij van synthetische biologie van het delen van middelen en 'extrinsieke ruis' die reactie dynamiek in levende cellen beïnvloedt. Maar vragen blijven hoe de fysieke omgeving waarin celvrije reacties worden ingebed beïnvloedt de voortgang en het resultaat van de reactie. Celvrije reactie omgevingen – in het bijzonder beperkt Environmenten die cel-relevante volumes te benaderen – blijven slecht gekarakteriseerd. Cell-allergene EiwitSynth (CFPS) is conventioneel gedacht als zijnde 'schaalvrije,' tentoonstellen gelijkwaardig kinetiek in een heel scala van microliter tot liter schaal reactie volumes 11. Toch is het opsluiten van reacties op cellulaire schaal volumes is aangetoond dat significante invloed eiwitexpressie tarieven 12.
De stochastische aard van cel-vrij reacties – vooral omdat deze systemen aanpak of zelfs naar beneden femtoliter volumes – kan zijn van bijzonder belang. Ruis in genexpressie is een eigenschap sterk beïnvloed door opsluiting als kleincellige volume en hoge dichtheden van componenten dwingen vele belangrijke moleculen zeer lage populatie – bijvoorbeeld Escherichia coli beperkt binnen 1 fl volume liefst 4.300 verschillende polypeptiden onder de induceerbare controle van honderden verschillende promoters 13. Dit inherente ruis is betrokken als een centrale drijvende kracht in tal van biologische processen, waaronder chemotaxis 14, de HIV beslissing tussen actieve replicatie en latency 15, de beslissing λ faag tussen lysis en lysogenie 16,17, en de Bacillus subtillus beslissing tussen competentie en sporulatie 17. Celvrije synthetische biologie biedt dan zowel een kans om de stochastische eigenschappen van cellulair gen circuits en netwerken onderzoeken en manipuleren deze gedragingen specifieke technologische doelen. Terwijl het geluid gedrag van cellulaire systemen is goed bestudeerde 18-27, is er weinig onderzoek naar de fundamentele geluid gedrag van cel-vrije systemen 8, met name op het cellulaire schaal.
Hier presenteren we een platform voor de studie van stochastische effecten in celvrije synthetische biologie. Dit microfabricated platform bevat femtoliter schaal reactie chambers die snel kunnen worden overgezet tussen open (gratis diffusie in en uit de kamer) en gesloten (reactanten opgesloten in de kamer) staten. In gesloten toestand, beperken wij celvrije eiwitsynthese (CFPS) reagentia expressie brengen van een groen fluorescerend eiwit (GFP), en volg genexpressie met behulp van time-lapse fluorescentiemicroscopie 28 (figuur 1). Wij kenmerken deze celvrije omgeving door meting van de structuur van de stochastische fluctuaties in genexpressie op een wijze direct analoog aan die toegepast om cellen te 25 karakteriseren. Niet-microfabricage werkwijzen voor het opsluiten celvrije reacties omvatten blaasjes en liposomen 29-32, water-in-olie emulsies 12 en poreuze media 33. Hoewel deze werkwijzen controle kan verschaffen over de grootteverdeling van de beperkte volumes 34, microfabricage werkwijzen maken zeer reproduceerbare eigenschappen met strak specifieke afmetingen, zelfs op nanoschaal.Bovendien kunnen deze starre structuren eenvoudig worden gevolgd in de tijd zonder gevoelig voor verdamping of veranderingen in de externe omgeving. Containerontwerpen microfabricated bij eerdere werk 8,35 niet snel afdichten reactiekamers volgende reactie initiatie, compliceert duidelijke toewijzing van de tijd dat de reactie werd gestart (tijdstip nul). Met de hier voorgestelde methode worden slechts 4-5 minuten nodig tussen initiatie en visualisatie van de reactie op het apparaat, waardoor een goed gedefinieerde "tijdstip nul". De volgende protocollen beschrijven de werkwijzen voor het vervaardigen en testen van het apparaat, waaronder optische lithografie, inrichtingsamenstel, testen apparaat en werkwijzen voor beeldanalyse.
Genexpressie in cellen is inherent luidruchtig te wijten aan kleine cellulaire volumes en lage aantal kopieën van belangrijke reactanten. Noise biologie vaak gericht op de bronnen, verwerking en biologische gevolgen van schommelingen in de populaties, concentraties posities of toestanden van moleculen dat gen circuits en netwerken 44 besturen. Het overgrote deel van dit werk is uitgevoerd in cellulaire systemen, die het voordeel van het bekijken van het geluid van een gen circuit in de natuurlijke context van het genetische netwerken binnen de cel. Echter, celvrije systemen kan de karakterisering van de intrinsieke fluctuaties van een individueel gen circuit zonder verstorende effecten extrinsieke 18 die niet kan worden vermeden cellulaire systemen. Analyse van lawaai kan belangrijke fysische inzichten bieden in hoe genetische circuits zijn gestructureerd en hoe ze functioneren, en is gebruikt in cellulaire systemen te karakteriseren negatieve 25 en positieve <sup> 27 autoregulatie, extrinsieke en intrinsieke bijdragen tot uitdrukking ruis 18, en transcriptionele barsten 45,46. Hier beschrijven we de studie van een celvrij expressiesysteem in microfluïdische inrichtingen die de gelijktijdige controle van reactorgrootte en reactietijden initatietijd inschakelen, zodat de rollen die opsluiting en verdringing 47,48 hebben op intrinsieke eiwitexpressie geluid zonder beter te begrijpen complicaties van levende cellen.
De sleuteltechnologieën eigenschap van het ontwerp is de integratie van arrays van femtoliter volume (micron-schaal) reactiekamers gebruikt voor het opsluiten van de reactanten van een celvrij expressiesysteem eiwit met een elastomeer "control valve" PDMS membraan dat vangt de reactanten in een goed gedefinieerde "tijdstip nul" voor reactie opening (figuur 1). Deze controle maakt de kinetiek van de bij eiwitsynthese reacties worden follverschuldigd in real time met hoge precisie. Als zodanig is het belangrijk om celvrije reactanten beheren dat inter-experimentele variabiliteit zoveel mogelijk geminimaliseerd. Deze regeling stelt ons ruis structuur celvrij genetische circuits evalueren op een wijze die analoog is aan die eerder werden gebruikt om genexpressie te evalueren in levende cellen.
Zoals reactanten in CFPS systemen gevoelig cycli bevriezen-ontdooien kan zijn, is het belangrijk dat de reactanten koud en minimaliseren van de tijd de reactanten besteden ontdooien op ijs. Het is een goede gewoonte om periodiek testen van de expressie van het CFPS systeem in bulk met het oog op de veranderingen in expressie niveaus in de tijd te identificeren – dit kan worden gedaan in een 10-15 ul reactie in een Eppendorf buis, of in een apparaat zoals een microplaataflezer , die meerdere uitvoert luidt tijd om reactiekinetiek vangen. Samen met de leeftijd en de dooi tijden van de reactanten voor elk experiment zal helpen bij het oplossen van lage expressie levels. Bovendien, bij het monteren CFPS reagentia, is het belangrijk op te merken dat de reactie begint zodra het volledig is geassembleerd en uit het ijs. Om een consistente "tijdstip nul" handhaven, is het nuttig om de tijd op te nemen na de inleiding van de CFPS reactie na de laatste toevoeging van de DNA-ingang, en de reactie zo spoedig mogelijk worden toegepast op de geïncubeerde apparaat. Dit proces duurt ongeveer 4-5 minuten duren, en fluorescentie mag nog niet zichtbaar in de reactiekamers zijn. Deze regeling zorgt ervoor dat de beschikbare tijd om de groei gedeelte van de reactiekromme visualiseren gemaximaliseerd.
Voordat u CFPS reacties op het apparaat, is het raadzaam om te draaien kwaliteitscontrole testen om te controleren of er geen lekkage uit de kamers. Een FRAP test kan worden uitgevoerd (zoals in figuur 2D) door een fluorofoor aan het apparaat en het blootstellen van een individu goed totdat de put volledig gebleekt. Als de kamers zijngoed afgesloten, geen herstel zichtbaar moet zijn in de put – moet er een schril contrast tussen de wanden van het compartiment en het interieur en exterieur ruimten zijn. Als fluorescentieherstel blijkt of de wanden van de reactiekamer zijn niet duidelijk vastgesteld, moet de druk op de regelklep worden verhoogd of moet worden gecheckt lekkage of delaminatie van het glaasje.
Dit protocol is getest met CFPS reagentia van een commerciële E. coli celvrije eiwitexpressie kit (geschaald tot 25 pl), hoewel andere robuuste CFPS kunnen worden gebruikt. Het is mogelijk hoeveelheid daarvan veel lager dan bij toepassing van 25 ul reacties op het apparaat, dat nuttig kan zijn bij het reagens kosten een beperkende factor experimenten. Als reagentia worden toegevoegd aan de inrichting en de reactiekamers zijn afgedicht, is het niet mogelijk om reactanten aan de oplossing toevoegen zonder-de bediening van de regelklep – dus dit apparaat niet suitable voor reacties die de toevoeging van reagentia tijdens de reactie vereist. Dit apparaat is eveneens niet geoptimaliseerd voor het waarnemen CFPS reacties die langer kan lopen dan 3 uur – de effecten van dehydratatie en drogen van de inrichting na deze periode werden niet onderzocht. Indien langere reactietijden gewenst, kunnen deze effecten worden beperkt door het afdichten van de inrichting om verdamping te voorkomen, veranderen de incubatietemperatuur, of met een vochtige kamer. Wijzigingen in het ontwerp apparaat, zoals nanoporeuze structuren in de kamerwanden 49,50 of het opnemen van een poreuze membraanlaag, vormen een aantal methoden die reagens Exchange kan dus verlengen reactie tijdschema.
Microfabricated reactie compartimenten van uniforme volume zijn waardevol voor het behoud van de dimensies op experimenten en zeer geschikt voor onderzoek naar "nevenreacties" met het compartiment muren. Unlike methoden waarbij geenn-microfabricated technieken, deze reacties moeten in kleine aantallen worden geëvalueerd, en geen dimensionale flexibiliteit biedt tijdens de experimenten. De regelbare ontwerp voor deze reactiekamers is zeer geschikt voor time-lapse microscopie en kan een verhelderende aanvulling van een high-throughput werkwijze opsluiting zijn.
The authors have nothing to disclose.
We thank Dr. Mitch Doktycz, Dr. Jennifer Morrel-Falvey, Dr. Amber Bible, and Dr. Brandon Razooky for helpful advice and conversations, and acknowledge Dr. Sukanya Iyer for constructing the Pet3a-EGFP plasmid used in the gene expression tests. We acknowledge support from the Center for Nanophase Materials Sciences, which is sponsored by the Scientific User Facilities Division, Office of Science, U.S. Department of Energy. SEN and PMC acknowledge support from Bredesen Center Fellowships at the University of Tennessee, Knoxville. This research was performed at Oak Ridge National Laboratory (ORNL). ORNL is managed by UT-Battelle, LLC, for the U.S. Department of Energy.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
SU-8 2015 | Microchem | SU-8 2000 series | Toxic. Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing. |
SU-8 Thinner | Microchem | SU-8 2000 series | Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing. |
SU-8 Developer | Microchem | SU-8 2000 series | Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing. |
Chlorotrimethylsilane | Sigma Aldrich | 92360 FLUKA | Hazardous. Corrosive to the respiratory tract., Reacts violently with water. |
Sylgard 184 PDMS | Dow Corning | SYLGARD 184 | |
0.75 mm hole-puncher | Ted Pella Inc. | 15072 | Harris Uni-Core |
23 ga needles blunt tip | Component Supply Co. | /NE-231PL-25 | |
#0 glass coverslip | Ted Pella Inc. | 260366 | Gold Seal |
Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | |
Microscope | Nikon Instruments | Eclipse TE 300 | |
CCD camera | Roper Scientific | CoolSNAP-HQ | |
Shutter | Shutter Insturment | Lambda SC | |
Light Source | Nikon | Intensilight C-HGFI | |
Color Filters | Chroma Technology Corp. | ZET 532/106 excitation, ZT 532rdc dichroic, ET 595/50m emission | |
100x oil-immersion objective | Nikon | N.A. 1.4 | |
Temperature Regulator | Oko Lab | H201-T | |
Metamorph | Universal Imaging Corp. | Version 7.8.3.0 | |
Marsh Bellofram transducers | Marsh Bellofram | T2000 | |
24 gauge PTFE tubing | Component Supply Co. | /SWTT-24-C | |
Septum vials | National Scientific | C4015- 17W | |
Power Supply | Hewlett Packard | 6205B Dual DC Power Supply | |
sharp 23 ga needles | Precision Glide | 305129 | |
Male-to-male luer lock adapters | Qosina | 20024 | Polycarbonate |
Stainless Steel Blunt Needle 23 Ga. | Component Supply Co. | /NE-232PL-5C | Polypropylene |
S30 E coli protein expression system | Promega | L1110 | |
Pet3a-GFP vector/protein | Novagen | 69418-3 | Assembled in-house. Inserted EGFP gene in Pet3a. |
Quantum Prep Plasmid Midiprep Kit | Biorad | #732-6120 | |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
Alexafluor 555 | Molecular Probes | AF555 | http://www.lifetechnologies.com |
ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | Version 1.46r | |
Plugin: Time Series Analyzer | Balaji J Dept. of Neurobiology, UCLA | Version 3.0 | |
Plugin: StackReg/TurboReg | Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne Biomedical Imaging Group | Distribution is dated July 7, 2011 | |
Plugin: ROI Manager Tools | Tiago Ferreira | 12/15/2013 Version |