A microfabricated device with sealable femtoliter-volume reaction chambers is described. This report includes a protocol for sealing cell-free protein synthesis reactants inside these chambers for the purpose of understanding the role of crowding and confinement in gene expression.
Systèmes exempts de cellules fournissent une plate-forme flexible pour sonder des réseaux spécifiques de réactions biologiques isolés du partage des ressources complexe (par exemple, l'expression globale des gènes, la division cellulaire) rencontré dans les cellules vivantes. Cependant, de tels systèmes, utilisés dans les réacteurs classiques en vrac macro-échelle, omettent souvent de présenter les comportements dynamiques et efficacité caractéristiques de leurs homologues de vie micro-échelle. Comprendre l'impact de la structure interne de la cellule et l'échelle sur la dynamique de réaction est cruciale pour comprendre les réseaux complexes de gènes. Nous rapportons ici un dispositif microfabriqué qui confine réactions acellulaires des volumes à l'échelle cellulaire tout en permettant la caractérisation flexible du système moléculaire clos. Ce poly multi-couche (diméthylsiloxane) (PDMS) contient dispositif chambres de réaction femtolitre échelle sur une membrane élastomère pouvant être actionné (ouverte et fermée). Lorsqu'il est actionné, les chambres confinent protéine cellulaire sans synthèse (CFPS) réactionsexprimant une protéine fluorescente, ce qui permet la visualisation de la cinétique de réaction au cours du temps en utilisant la microscopie time-lapse fluorescente. Ici, nous montrons comment ce dispositif peut être utilisé pour mesurer la structure de bruit de réactions CFPS d'une manière qui est directement analogue à ceux utilisés pour caractériser des systèmes cellulaires, ce qui permet l'utilisation de techniques bruit de biologie utilisés dans les systèmes cellulaires de caractériser circuits de gènes CFPS et leurs interactions avec l'environnement exempt de cellules.
Systèmes exempts de cellules offrent une plate-forme simplifiée et flexible pour la visualisation des réactions biologiques exempt de facteurs de complication tels que le fitness, la division, et la mutation qui sont inévitables dans l'étude des cellules vivantes. Ces approches ont été utilisées pour étudier des systèmes cellulaires, y compris la caractérisation de protéines de la membrane 1, le palpage de deux interactions de protéines, et l'exploration des aspects fondamentaux de la traduction 7.3. Récemment systèmes exempts de cellules ont commencé à se implanter comme plates-formes viables pour la biologie synthétique 8-10. L'appel de ces approches est qu'elles libèrent la biologie synthétique du partage des ressources et «bruit extrinsèque» qui affecte la dynamique des réactions dans les cellules vivantes. Cependant des questions subsistent quant à la façon dont l'environnement physique dans lequel les réactions sans cellules sont intégrées affecte la progression et les résultats de la réaction. Environnements de réaction sans cellules – environnem particulièrement limitéeparents qui se approchent volumes cellulaires pertinents – restent mal caractérisés. protéine cellulaire sans Synthèse (CFPS) est pensée conventionnelle comme étant 'échelle libre,' présentant une cinétique équivalentes à travers une gamme de microlitre à des volumes de réaction litre échelle 11. Néanmoins, il a été démontré réactions de confinement à des volumes de l'échelle cellulaire à affecter de manière significative les taux d'expression de protéines 12.
La nature stochastique de réactions sans cellules – d'autant plus que ceux-ci approche systémique ou même aller au-dessous femtolitre volumes – peuvent être d'une importance particulière. Le bruit dans l'expression des gènes est un établissement fortement influencé par confinement que les volumes de petites cellules et de fortes densités de composants forcer un grand nombre de molécules importantes à des niveaux de population très faibles – par exemple, Escherichia coli limites dans un volume de 1 fl jusqu'à 4300 polypeptides différents sous le contrôle inductible de plusieurs centaines de promoteurs différents 13. Ce bruit inhérent a été impliquée en tant que force d'entraînement central dans de nombreux processus biologiques, y compris la chimiotaxie 14, la décision du VIH entre réplication active et la latence 15, la décision λ de phages entre la lyse et la lysogénie 16,17, et la décision de Bacillus subtillus entre compétence 17 et la sporulation. La biologie synthétique acellulaire fournit alors à la fois l'occasion d'explorer les propriétés stochastiques de circuits et de réseaux de gènes cellulaires, et manipuler ces comportements pour atteindre les objectifs technologiques spécifiques. Bien que le comportement de bruit des systèmes cellulaires a été bien étudié 18-27, il ya eu peu d'exploration du comportement de bruit fondamentale des systèmes sans cellules 8, en particulier à l'échelle cellulaire.
Ici, nous présentons une plate-forme pour l'étude des effets stochastiques dans la biologie synthétique acellulaire. Cette plate-forme contient microfabriquée réaction femtolitre échelle chambers qui peut être rapidement effectué la transition entre ouverte (diffusion libre dans et hors de la chambre) et fermées (réactifs confinés dans la chambre) états. Dans l'état fermé, nous limitons la synthèse des protéines (CFPS) réactifs cellulaires sans exprimant une protéine fluorescente verte (GFP), et de suivre l'expression des gènes en utilisant time-lapse microscopie de fluorescence 28 (Figure 1). Nous caractérisons cette environnement exempt de cellules en mesurant la structure des fluctuations stochastiques de l'expression génique d'une manière directement analogue à ceux utilisés pour caractériser des cellules 25. Les méthodes non-microfabrication pour confiner réactions acellulaires comprennent des vésicules et des liposomes 29-32, émulsions eau-dans-huile, 12 et 33 milieux poreux. Cependant, alors que ces méthodes peuvent fournir un contrôle sur la distribution de la taille des volumes confinés 34, les méthodes de microfabrication créent fonctionnalités très reproductibles avec des dimensions étroitement définis, même à l'échelle nanométrique.En outre, ces structures rigides peuvent être facilement suivis dans le temps sans être sensibles à l'évaporation ou des changements dans l'environnement externe. Conceptions de conteneurs utilisés dans microfabriqués précédente 8,35 de travail ne peut pas sceller rapidement les chambres de réaction suite à l'initiation de la réaction, ce qui complique l'attribution claire de l'époque où la réaction a été lancé (temps zéro). Utilisation de la méthode présentée ici, seulement 4 à 5 min est nécessaire entre le début et la visualisation de la réaction de l'appareil, fournissant ainsi un «temps zéro» bien définie. Les protocoles suivants décrivent les procédés de fabrication et de tester cet appareil, y compris la lithographie optique, l'assemblage de l'appareil, les tests de l'appareil, et les méthodes pour l'analyse d'image.
L'expression des gènes dans les cellules est intrinsèquement bruyant à cause de petits volumes cellulaires et faible nombre de copies de réactifs importants. Bruit biologie se concentre souvent sur les sources, le traitement, et les conséquences biologiques des fluctuations dans les populations, les concentrations, les positions, ou des états de molécules qui contrôlent les circuits et les réseaux 44 gènes. La grande majorité de ce travail a été effectué dans les systèmes cellulaires, ce qui a l'avantage de voir le bruit d'un circuit de gène dans le contexte naturel des réseaux génétiques dans la cellule. Cependant, les systèmes exempts de cellules permettent la caractérisation des fluctuations intrinsèques d'un circuit de gène individuel sans les effets extrinsèques de confusion 18 qui ne peuvent pas être évités dans les systèmes cellulaires. Analyse du bruit peut donner des indications physiques importantes sur la façon dont sont structurés génétique circuits et comment ils fonctionnent, et a été utilisé dans les systèmes cellulaires pour caractériser négative et positive 25 <sup> 27 autorégulation, extrinsèques et intrinsèques contributions au bruit d'expression 18, et la transcription éclatement 45,46. Nous décrivons ici l'étude d'un système d'expression acellulaire dans des dispositifs microfluidiques qui permettent le contrôle simultané de la taille du réacteur et initiation de temps de réaction, afin de mieux comprendre les rôles que l'isolement et l'encombrement 47,48 ont sur le bruit de l'expression des protéines intrinsèque sans les complications associées à des cellules vivantes.
La caractéristique essentielle de la conception favorable est l'intégration de réseaux de femtolitre-volume (échelle du micron) des chambres de réaction utilisées pour confiner les réactifs d'un système d'expression de protéine sans cellule, avec une «soupape de commande» membrane élastomère dans PDMS qui emprisonne le réactifs à une, "temps zéro" bien définie pour l'initiation de réaction (figure 1). Ce contrôle permet la cinétique des réactions mises en jeu dans la synthèse des protéines à SSdû en temps réel avec une grande précision. En tant que tel, il est important de gérer réactifs exempts de cellules de sorte que la variabilité inter-expérimental est minimisée autant que possible. Ce contrôle permet d'évaluer le bruit de structure de circuits génétiques exempts de cellules d'une manière qui est analogue aux techniques précédemment utilisées pour évaluer l'expression du gène dans des cellules vivantes.
Comme réactifs utilisés dans les systèmes de CFPS peuvent être sensibles à cycles gel-dégel, il est important de garder les réactifs froid et minimiser le temps les réactifs passent décongélation sur de la glace. Il est recommandé de tester périodiquement l'expression du système CFPS en vrac afin d'identifier les changements dans les niveaux d'expression au fil du temps – cela peut être fait dans une réaction de 10 à 15 pi dans un tube Eppendorf, ou dans un appareil comme un lecteur de microplaques , qui effectue plusieurs lectures au fil du temps pour capturer cinétique de réaction. Notant les temps de l'âge et dégel des réactifs pour chaque expérience aidera lors du dépannage faible expression lNIVEAUXATTEINTSPARLEP ASSE. En outre, lors de l'assemblage des réactifs de CFPS, il est important de noter que la réaction commence une fois qu'il est complètement monté et retiré de la glace. Afin de maintenir un "temps zéro" compatibles, il est utile d'enregistrer le temps suivant l'initiation de la réaction de CFPS après l'addition finale de l'entrée de l'ADN, et la réaction d'appliquer le plus rapidement possible pour le dispositif incubé. Ce processus devrait prendre environ 4-5 min, et la fluorescence ne doit pas encore être visible dans les chambres de réaction. Ce contrôle assure que le temps disponible pour visualiser la partie de croissance de la courbe de réaction est maximisée.
Avant d'exécuter des réactions de CFPS sur l'appareil, il est conseillé d'effectuer des tests de contrôle de qualité afin de vérifier l'absence de fuite dans les chambres. Un test peut être effectué FRAP (comme sur la figure 2D) par application d'un fluorophore à l'appareil et l'exposition d'un puits individuel jusqu'à ce que le puits est entièrement blanchie. Si les chambres sontbien scellé, pas de reprise devrait être visible à l'intérieur du puits – il devrait y avoir un contraste frappant entre les parois du compartiment et les espaces intérieurs et extérieurs. Si la récupération de fluorescence ressort ou les parois de la chambre de réaction ne est pas bien définie, la pression sur la vanne de commande doit être augmentée ou le dispositif doit être vérifiée pour les fuites ou la délamination de la lame de verre.
Ce protocole a été testé avec des réactifs de CFPS d'un E. commerciale Kit coli acellulaire expression de la protéine (à l'échelle de 25 ul), bien que d'autres systèmes de CFPS solide peuvent être utilisés. Il est possible d'utiliser des volumes beaucoup plus bas que 25 pi lors de l'application des réactions à l'appareil, ce qui peut être utile lorsque le coût de réactif est un facteur limitant dans les expériences. Une fois que les réactifs sont ajoutés dans le dispositif et les chambres de réaction sont scellées, il ne est pas possible d'ajouter des réactifs à la solution sans actionnement de la soupape de commande – par conséquent ce dispositif ne est pas suitable pour les réactions qui nécessitent l'addition de réactifs au cours de la réaction. Ce dispositif est également pas optimisé pour l'observation des réactions CFPS qui peut exécuter plus de trois heures – les effets de la déshydratation et le séchage de l'appareil après cette période ne ont pas été évalués. Si de plus longues durées de réaction sont souhaités, ces effets peuvent être atténués par le dispositif d'étanchéité pour éviter l'évaporation, à modifier la température d'incubation, ou en utilisant une chambre d'humidité. Les modifications apportées à la conception de l'appareil, telles que les structures nanoporeux dans les parois de la chambre 49,50 ou l'inclusion d'une couche de membrane poreuse, représentent quelques méthodes qui pourraient permettre l'échange de réactifs et donc allonger les délais de réaction.
Compartiments de réaction microfabriqués volume uniforme sont précieux pour le maintien des dimensions cohérentes à l'échelle des expériences et très approprié pour enquête sur "les réactions secondaires" avec les parois du compartiment. Contrairement aux méthodes qui ne utilisent pastechniques n-usinée, ces réactions doivent être évalués en petit nombre, et ne fournissent pas la souplesse dimensionnelle lors des expériences. Cependant, la conception contrôlable pour ces chambres de réaction est très approprié pour la microscopie time-lapse, et peut être un complément d'éclairage à une méthode à haut débit de l'accouchement.
The authors have nothing to disclose.
We thank Dr. Mitch Doktycz, Dr. Jennifer Morrel-Falvey, Dr. Amber Bible, and Dr. Brandon Razooky for helpful advice and conversations, and acknowledge Dr. Sukanya Iyer for constructing the Pet3a-EGFP plasmid used in the gene expression tests. We acknowledge support from the Center for Nanophase Materials Sciences, which is sponsored by the Scientific User Facilities Division, Office of Science, U.S. Department of Energy. SEN and PMC acknowledge support from Bredesen Center Fellowships at the University of Tennessee, Knoxville. This research was performed at Oak Ridge National Laboratory (ORNL). ORNL is managed by UT-Battelle, LLC, for the U.S. Department of Energy.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
SU-8 2015 | Microchem | SU-8 2000 series | Toxic. Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing. |
SU-8 Thinner | Microchem | SU-8 2000 series | Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing. |
SU-8 Developer | Microchem | SU-8 2000 series | Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing. |
Chlorotrimethylsilane | Sigma Aldrich | 92360 FLUKA | Hazardous. Corrosive to the respiratory tract., Reacts violently with water. |
Sylgard 184 PDMS | Dow Corning | SYLGARD 184 | |
0.75 mm hole-puncher | Ted Pella Inc. | 15072 | Harris Uni-Core |
23 ga needles blunt tip | Component Supply Co. | /NE-231PL-25 | |
#0 glass coverslip | Ted Pella Inc. | 260366 | Gold Seal |
Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | |
Microscope | Nikon Instruments | Eclipse TE 300 | |
CCD camera | Roper Scientific | CoolSNAP-HQ | |
Shutter | Shutter Insturment | Lambda SC | |
Light Source | Nikon | Intensilight C-HGFI | |
Color Filters | Chroma Technology Corp. | ZET 532/106 excitation, ZT 532rdc dichroic, ET 595/50m emission | |
100x oil-immersion objective | Nikon | N.A. 1.4 | |
Temperature Regulator | Oko Lab | H201-T | |
Metamorph | Universal Imaging Corp. | Version 7.8.3.0 | |
Marsh Bellofram transducers | Marsh Bellofram | T2000 | |
24 gauge PTFE tubing | Component Supply Co. | /SWTT-24-C | |
Septum vials | National Scientific | C4015- 17W | |
Power Supply | Hewlett Packard | 6205B Dual DC Power Supply | |
sharp 23 ga needles | Precision Glide | 305129 | |
Male-to-male luer lock adapters | Qosina | 20024 | Polycarbonate |
Stainless Steel Blunt Needle 23 Ga. | Component Supply Co. | /NE-232PL-5C | Polypropylene |
S30 E coli protein expression system | Promega | L1110 | |
Pet3a-GFP vector/protein | Novagen | 69418-3 | Assembled in-house. Inserted EGFP gene in Pet3a. |
Quantum Prep Plasmid Midiprep Kit | Biorad | #732-6120 | |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
Alexafluor 555 | Molecular Probes | AF555 | http://www.lifetechnologies.com |
ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | Version 1.46r | |
Plugin: Time Series Analyzer | Balaji J Dept. of Neurobiology, UCLA | Version 3.0 | |
Plugin: StackReg/TurboReg | Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne Biomedical Imaging Group | Distribution is dated July 7, 2011 | |
Plugin: ROI Manager Tools | Tiago Ferreira | 12/15/2013 Version |