This paper provides a method for investigating neurotransmitter vesicle dynamics in neuroblastoma cells, using a synaptobrevin2-pHluorin construct and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. The strategy developed for image processing and data analysis is also reported.
Synaptische blaasjes los neurotransmitters bij chemische synapsen door middel van een dynamische cyclus van fusie en ophalen. Monitoring synaptische activiteit in real time en het ontleden van de verschillende stappen van exo-endocytose bij de enkele vesicle niveau cruciaal voor het begrijpen synaptische functies in gezondheid en ziekte.
Genetisch gecodeerde pH-gevoelige sondes direct gericht aan synaptische blaasjes en totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie (TIRFM) zorgen voor de ruimtelijke resolutie nodig is om blaasje dynamiek volgen. Het oneindig kleine veld door totale interne reflectie alleen prikkelen fluoroforen in een dunne laag (<150 nm) boven de glasplaat waarop cellen hechten, waar de processen van exo-endocytose plaatsvinden. De resulterende beelden met hoog contrast zijn bij uitstek geschikt voor het bijhouden van blaasjes en kwantitatieve analyse van fusie-evenementen.
In dit protocol, SH-SY5Y menselijke neuroblastoma cellen worden voorgesteld als een waardevol model voor het bestuderen van neurotransmitter afgifte bij de enkele-vesikel niveau TIRFM vanwege hun platte oppervlak en de aanwezigheid van gedispergeerde vesicles. De methoden voor het kweken SH-SY5Y als hechtende cellen en het transfecteren hen synapto-pHluorin voorzien, alsook de techniek om TIRFM en beeldvorming uitvoeren. Tenslotte wordt een strategie voor selecteren, tellen en analyseren fusiegebeurtenissen in whole-cell en single-vesikel niveaus gepresenteerd.
Om de beeldvorming procedure en de data-analyse benadering te valideren, zijn de dynamiek van pHluorin-tagged blaasjes geanalyseerd onder rust en gestimuleerd (depolariserende kalium concentraties) voorwaarden. Membraandepolarisatie verhoogt de frequentie van fusie evenementen en veroorzaakt een parallelle verhoging van de netto fluorescentie signaal opgenomen in hele cel. Single-blaasje analyse blijkt modificaties van fusie-event gedrag (verhoogde piek hoogte en breedte). Deze gegevens suggereren thop kalium depolarisatie niet alleen leidt tot een massale afgifte van neurotransmitters, maar wijzigt ook het mechanisme van de vesikel fusie en recycling.
Met de juiste fluorescente probe, kan deze techniek worden toegepast in verschillende cellulaire systemen om de mechanismen van constitutieve en gestimuleerde secretie ontleden.
Chemische synaptische transmissie tussen neuronen is een belangrijk mechanisme van communicatie in het zenuwstelsel. Zij beroept zich op de afgifte van neurotransmitters door middel van een dynamische cyclus van vesikel fusie en de afhaling aan het presynaptische website. Veel van de betrokken blaasje dynamiek eiwitten zijn geïdentificeerd; Hun specifieke bijdrage aan het verschijnsel nog worden opgehelderd 1.
Ons begrip wordt gedeeltelijk beperkt door het feit dat de meest gebruikte testen voor exo / endocytose niet altijd de meest geschikte. Verschillende studies met betrekking tot de vesikel fusie en dynamiek vertrouwen op elektrofysiologische technieken. Deze techniek biedt een optimale temporele resolutie en is uitstekend voor het onderzoeken van de initiële fusie van blaasjes naar de plasmamembraan maar kan veel van de onderliggende moleculaire gebeurtenissen die presynaptische functie ondersteunen detecteren. Elektronenmicroscopie, aan de andere kant biedt de beste morphological beschrijving van elke afzonderlijke stap, maar het dynamische aspect van het evenement kan niet worden gevangen, want monsters moeten worden vastgesteld om te worden geanalyseerd.
De komst van nieuwe optische opnametechniek 2,3, in combinatie met de vooruitgang in de moleculaire fluorescente probes ontwikkeling 6/4, zodat de visualisatie van exocytose processen in levende cellen, waardoor nieuwe niveaus van informatie over de synaptische structuur en functie.
De eerste studies uitgebuit activiteit-afhankelijke styrylkleurstoffen (FM1-43 en aanverwante organische kleurstoffen) 7,8. State-of-the-art beeldvormende technieken gebruiken pH-gevoelige varianten van de Green Fluorescent Protein (GFP) (pHluorin) vastgebonden aan luminale blaasjes eiwitten 9. Deze probes worden gewoonlijk uitgeschakeld wanneer aanwezig in de blaasjes vanwege de lage luminale pH. Na fusie met de plasmamembraan, is het blaasje inwendige blootgesteld aan de neutrale extracellulaire ruimte, de pH abrupt verhoogt, ontlast de proton-afhankelijke blussen van pHluorin en de tl-signaal snel verschijnt. Aangezien de verandering in pHluorin sneller is dan de samensmelting door het volgen fluorescentie verhoogd, kan blaasje fusie met het membraan worden gemeten en geanalyseerd. Omdat oppervlakte-pHluorin gemerkte moleculen worden endocytosed, het fluorescentiesignaal vervolgens terug naar het basale niveau, dus dezelfde construct kan ook worden gebruikt om vesicle recycling 9 volgen.
Terwijl de vesicle gelabeld pH-sensor zorgt voor het visualiseren alleen die vesicles die echt fuseren met de plasmamembraan, is beeldvorming in hoge ruimtelijke en temporele resolutie vereist beschrijven in detail de stappen van het exo / endocytische processen. De optische techniek die de nodige ruimtelijke resolutie biedt, is de totale interne reflectie fluorescentie microscopie (TIRFM), een toepassing van fluorescentie microscopie 10.
"> Totale interne reflectie optreedt aan het grensvlak tussen de glazen afdekking slip en het monster. Wanneer het lichtpad het glazen deksel slip met een invalshoek groter dan de kritische hoek bereikt, wordt het excitatielicht niet uitgezonden in het monster maar volledig teruggekaatst. Onder deze omstandigheden is een uitdovende lichtgolf vormen op het grensvlak en propageert in het medium met minder optische dichtheid (monster). Omdat de intensiteit van het verdwijnende veld exponentieel af met de afstand van de interface (met een penetratiediepte van ongeveer 100 nm) in de fluoroforen in dichtste nabijheid van de cover-slip kan worden opgewekt terwijl die verder van de begrenzing niet. In cellen getransfecteerd met GFP-constructen, die diepte overeenkomt met eiwitten aanwezig op het plasmamembraan of vesiculaire structuren benaderen. Zoals fluoroforen in de cel interieur niet kan worden opgewekt, wordt de achtergrond fluorescentie geminimaliseerd, en een beeld met een zeer hoge signaal / achtergrond ratio wordt gevormd 11.Verschillende kenmerken maken TIRFM de techniek van keuze voor het bewaken van blaasjes dynamiek. De perfecte contrast en hoge signaal-ruisverhouding kan de detectie van zeer lage signalen afkomstig van één blaasjes. -Chip gebaseerde beeld acquisitie in elk frame biedt de temporele resolutie die nodig zijn om zeer dynamische processen op te sporen. Ten slotte is de minimale blootstelling van cellen aan het licht op een ander vliegtuig in de steekproef vermindert sterk fototoxiciteit en maakt langdurige time-lapse-opname 12.
Data-analyse blijft de meest uitdagende en cruciaal aspect van deze techniek. De eenvoudigste manier om vesikel fusie monitoren is de accumulatie van reporter fluorescente eiwitten op het celoppervlak meten gedurende 13. Als fusie toeneemt, netto fluorescentie signaal stijgt ook. Echter, deze werkwijze het proces onderschatten, vooral in grote cellen en in rusttoestand,omdat endocytose en fotobleking processen compenseren de toename van de fluorescentie-intensiteit als gevolg van blaasje exocytose. Een alternatieve methode is om elk afzonderlijk samensmelting 14 volgen. Deze laatste methode is zeer gevoelig en kan belangrijke informatie over het fusie mechanismen onthullen. Het vereist echter de handmatige selectie van enkele gebeurtenissen, want volledig geautomatiseerde procedures om blaasjes te volgen en de fluctuatie van hun fluorescerende signalen registreert zijn niet altijd beschikbaar. Observatie van vesicle dynamica vereist bemonstering cellen bij hoge frequentie. Dit genereert een grote hoeveelheid gegevens die nauwelijks handmatig kan worden geanalyseerd.
Het voorstel van dit artikel is het TIRFM beeldvormingstechniek optimaliseren voor bewaking van de basale en gestimuleerde neurotransmitters in de SH-5YSY neuroblastoma cellijn, en beschrijven, stap voor stap een werkwijze ontwikkeld in het laboratorium te analyseren, zowel in whole-cell en single-vesikel levels.
In deze paper wordt een protocol om imago en blaasjes dynamiek analyseren afscheidende cellen, met behulp van fluorescentie-cDNA gecodeerde vectoren en TIRFM. Belangrijke elementen van succesvolle beeldvorming door TIRFM zijn de selectie van de cellulaire model en celtransfectie met genetisch gecodeerde optische indicatoren van blaasje vrijkomen en recycling.
TIRFM is bij uitstek geschikt voor groeiende cellen aanhanger van een glazen deksel en voldoende vlak om een stabiele visualisat…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs willen graag aan de Università degli Studi di Milano erkennen voor steun aan Eliana Di Cairano (post-doctorale beurs) en Stefania Moretti (Ph.D. fellowship). Dit werk werd ondersteund door de Universiteit Research Program PUR naar CP
We willen graag Prof. Jeremy M. Henley, School van Biochemie, Universiteit van Bristol, Verenigd Koninkrijk, bedanken voor de pHluorin bouwen en Dr. Dotti Francesco voor hulp bij data-analyse, en Silvia Marsicano voor technische ondersteuning.
Equipment | ||||
Axio Observer Z1 | Zeiss | 491912-9850-000 | inverted microscope http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/light-microscopes/axio-observer-for-biology.html#introduction |
|
Multiline Argon Laser Lasos 77 | Lasos | 00000-1312-752 | multi-line (458/488/514 nm), 100mW argon-ion laser http://www.lasos.com/products/argon-ion-laser |
|
Laser TIRF slider | Zeiss | 423681-9901-000 | http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/imaging-systems/single-molecular-imaging-laser-tirf-3.html | |
100x Objective | Zeiss | 421190-9900-000 | Oil, NA 1.45 Alpha-Plan https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&p=us&f=o&a=v&m=a&id=421 190-9900-000&ss=1 |
|
CCD Camera RetigaSRV Fast 1394 | QImaging | http://www.qimaging.com/products/datasheets/Retiga-SRV.pdf | ||
LAMBDA 10-3 optical filter changer with SmartShutter | Sutter Instrument Company | http://www.sutter.com/IMAGING/lambda103.html | ||
Software | ||||
Image ProPlus 6.3 Software | Media Cybernetics | spot selection, ROI selection, fluorescence intensity determination http://www.mediacy.com/index.aspx?page=IPP |
||
Excel | Microsoft | photobleaching correction, whole-cell and single-vesicle analyses http://office.microsoft.com/it-it/excel/ |
||
GraphPad Prism 4.00 | GraphPad Software, Inc. | statistical analysis http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ |