This paper provides a method for investigating neurotransmitter vesicle dynamics in neuroblastoma cells, using a synaptobrevin2-pHluorin construct and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. The strategy developed for image processing and data analysis is also reported.
突触囊泡融合,通过和检索的动态循环释放神经递质的化学突触。 实时监测突触活动和解剖的不同步骤外-内吞作用的单囊泡水平对于理解在健康和疾病突触功能至关重要。
遗传编码的PH敏感的探针直接靶向突触小泡和全内反射荧光显微镜(TIRFM)提供必要遵循囊泡动力学的时空分辨率。通过全内反射所产生的渐逝场只能激发置于一薄层(<150纳米),其上的细胞粘附在玻璃盖之上的荧光团,正是外 – 内吞作用的过程发生。所得高对比度的图像非常适合囊泡跟踪和融合事件的定量分析。
在这个协议中,SH-SY5Y人N-euroblastoma细胞被提出作为一种有价值的模型为研究,因为他们的平坦面神经递质释放在通过TIRFM单囊泡水平,并分散囊泡的存在。被提供的方法用于生长的SH-SY5Y以贴壁细胞和与突触-pHluorin染它们,以及执行TIRFM和成像技术。最后,战略目标选择,计数和分析,在全细胞和单囊泡融合水平的事件呈现。
为了验证成像过程和数据分析方法,pHluorin标记的囊泡的动力学下休息了分析和刺激(去极化钾浓度)的条件。膜去极化增加的融合事件的频率,并导致记录在全细胞的净荧光信号的并行加注。单囊泡分析揭示聚变事件行为(上升峰的高度和宽度)的修饰。这些数据表明,第在钾去极化不仅诱导大量神经递质释放,而且修改囊泡融合和再循环的机制。
用适当的荧光探针,该技术可以在不同的蜂窝系统可以采用解剖构和刺激分泌的机制。
神经元之间的化学突触传递是通信中的神经系统的主要机制。它依赖于神经递质通过囊泡融合和检索的动态循环的释放在突触前部位。许多参与囊泡动力学的蛋白质已被鉴定;然而,它们对这一现象的具体贡献仍有待阐明1。
我们的理解是由以下事实最广泛使用的测定法外/胞吞作用并不总是最合适的部分的限制。相关囊泡融合一些研究和动态依靠电生理技术。这种技术提供了一个最佳的时间分辨率和优良调查囊泡至质膜的初始熔化,但无法检测到许多支持突触功能的基本分子事件。电子显微镜,在另一侧,提供了最好的morphologica每个奇异步骤,但是事件的动态方面的升说明不能被捕获,因为样品必须固定以便进行分析。
的新的光记录技术2,3,结合在荧光分子探针发展4-6进步的出现,使得在活细胞中胞吐过程的可视化,从而提供约突触的结构和功能的信息的新的水平。
最初的研究开发活动相关的苯乙烯染料(FM1 – 43和相关有机染料)7,8。国家的最先进的成像技术采用了绿色荧光蛋白(GFP)(pHluorin)拴管腔小泡蛋白9的pH敏感的变体。这些探针通常被关闭,因为低pH值管腔的囊泡当存在时。融合与质膜后,囊泡内部暴露于中性细胞外空间中,pH突然增加,缓解pHluorin的质子依赖淬火和荧光信号迅速出现。如pHluorin的变化的速度比的融合事件,通过监测荧光的增加,囊泡融合与膜可以测量和分析。因为表面pHluorin标签的分子被内吞,所述荧光信号随后返回到基础水平,因此也可以使用相同的构建体并监控囊泡再循环9。
而囊泡标记的pH传感器可以确保只有那些囊泡真正融合与质膜的可视化,成像在高空间和时间分辨率是必需的,以详细描述了所涉及的外/内吞过程的步骤。的光学技术,它提供了必要的时空分辨率为全内反射荧光显微镜(TIRFM),荧光显微镜10的应用程序。
“>全内反射发生在玻璃盖玻片和样品。当光路到达玻璃盖玻片用的入射角比临界角大的界面,激发光不被传递到样品,但完全反射回去。在这些条件下,一个瞬逝光波的形式在界面处,并传播与较少的光密度(样品)的平台。由于渐逝场的强度呈指数衰减的距离从接口(具有穿透深度约100nm)只在最接近于盖滑移的荧光团可被激发而更远离边界都没有。在转染的细胞用GFP-构建体,该深度对应于表示在质膜上的蛋白质或在囊泡结构接近它。如在细胞内部的荧光团可以不被激励时,所述背景荧光最小化,并具有非常高的信号/背景的大鼠的图像IO形成11。有几个特点使选择的TIRFM技术监测囊泡动态。完美的对比度和高的信号 – 噪声比允许非常低的信号从单个囊泡导出的检测。在各帧的基于芯片的图像采集提供必要检测高动态过程的时间分辨率。最后,细胞的最小曝光的样品中任何其他飞机大大地减少光毒性,并能持久延时录制12。
数据分析仍然这种技术的最具挑战性的和关键的方面。监视囊泡融合的最简单的方法是测量报告荧光蛋白在细胞表面的积累,随着时间的推移13。作为融合的增加,净荧光信号也增加。然而,这种方法可能会低估的过程中,特别是在大的细胞和在静止的条件下,因为内吞作用和漂白过程偏移由于囊泡的胞吐作用的增加的荧光强度。另一种方法是按照每个单个融合事件14。这后一种方法是很敏感的,并且可以揭示关于融合的机制的重要细节。然而,它要求手动选择单一活动,因为完全自动化程序遵循囊泡和登记他们的荧光信号的波动并不总是可用。囊泡动力学的观察要求采样单元在高频率。这会产生大量的数据,可以几乎不进行手动分析。
本文的建议是优化TIRFM成像技术用于监测基底和刺激的神经递质释放,在SH-5YSY神经母细胞瘤细胞系,并描述,一步一步,在实验室中开发的程序来分析数据,既在全细胞和单囊泡水平。
本文提出了一种协议,以图像和分析囊泡动力学分泌细胞,采用荧光基因编码向量和TIRFM。成功的成像通过TIRFM关键要素是细胞模型和细胞转染与囊泡释放和回收的基因编码的光学指标的选择。
TIRFM非常适合于细胞生长附着于玻璃盖和足够平坦以使膜融合事件的稳定可视化。囊泡最好应分散在细胞使它们的贩卖,融合和胞吞作用可以被成像和量化在单囊泡水平。不幸的是,神?…
The authors have nothing to disclose.
笔者想承认UNIVERSITA德利阿布鲁Studi住宅米兰向埃利安娜迪卡伊拉诺(博士后奖学金)和斯特凡莫雷蒂(博士奖学金)的支持。这项工作是由大学研究计划PUR到CP支持
我们要感谢教授杰里米·M.亨利,生物化学学院,布里斯托,英国的大学,为pHluorin建设和Dotti弗朗西斯博士在数据分析的援助,和Silvia Marsicano技术援助。
Equipment | ||||
Axio Observer Z1 | Zeiss | 491912-9850-000 | inverted microscope http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/light-microscopes/axio-observer-for-biology.html#introduction |
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Multiline Argon Laser Lasos 77 | Lasos | 00000-1312-752 | multi-line (458/488/514 nm), 100mW argon-ion laser http://www.lasos.com/products/argon-ion-laser |
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Laser TIRF slider | Zeiss | 423681-9901-000 | http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/imaging-systems/single-molecular-imaging-laser-tirf-3.html | |
100x Objective | Zeiss | 421190-9900-000 | Oil, NA 1.45 Alpha-Plan https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&p=us&f=o&a=v&m=a&id=421 190-9900-000&ss=1 |
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CCD Camera RetigaSRV Fast 1394 | QImaging | http://www.qimaging.com/products/datasheets/Retiga-SRV.pdf | ||
LAMBDA 10-3 optical filter changer with SmartShutter | Sutter Instrument Company | http://www.sutter.com/IMAGING/lambda103.html | ||
Software | ||||
Image ProPlus 6.3 Software | Media Cybernetics | spot selection, ROI selection, fluorescence intensity determination http://www.mediacy.com/index.aspx?page=IPP |
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Excel | Microsoft | photobleaching correction, whole-cell and single-vesicle analyses http://office.microsoft.com/it-it/excel/ |
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GraphPad Prism 4.00 | GraphPad Software, Inc. | statistical analysis http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ |