概要

Cultura primária de neurônios dopaminérgicos mouse

Published: September 08, 2014
doi:

概要

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson’s disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

Abstract

Neurónios dopaminérgicos representam menos de 1% do número total de neurónios no cérebro. Esta baixa quantidade de neurônios regula funções importantes do cérebro, como controle motor, motivação e memória de trabalho. Neurônios dopaminérgicos nigrostriatal degenerar seletivamente na doença de Parkinson (DP). Esta perda neuronal progressiva é inequivocamente associado aos motores sintomas da patologia (bradicinesia, tremor de repouso, rigidez muscular e). O principal agente responsável dos neurônios dopaminérgicos degeneração ainda é desconhecida. No entanto, esses neurônios parecem ser extremamente vulneráveis ​​em diversas condições. As culturas primárias constitui um dos modelos mais relevantes para investigar as propriedades e características de neurónios dopaminérgicos. Estas culturas podem ser submetidos a vários agentes estressores que imitam PD patologia e compostos neuroprotetores, a fim de parar ou abrandar a degeneração neuronal. Os inúmeros modelos de camundongos transgênicos do PD que foram generciados durante a última década aumentou ainda mais o interesse dos pesquisadores para as culturas de neurónios dopaminérgicos. Aqui, o protocolo de vídeo concentra-se na dissecação delicada de cérebros embrionárias de rato. Excisão precisa do mesencéfalo ventral é crucial para obter culturas neuronais suficientemente ricos em células dopaminérgicas para permitir estudos posteriores. Este protocolo pode ser realizado com camundongos transgênicos embrionárias e é adequado para imunofluorescência, PCR quantitativo, segundo quantificação mensageiro, ou avaliação morte / sobrevivência neuronal.

Introduction

A dopamina, um dos neurotransmissores cerebrais essenciais 1,2, é libertada principalmente por dopaminérgicos do mesencéfalo (AD) neurónios. A maioria dos neurónios DA residir na parte ventral do mesencéfalo 2-6. Esquematicamente, neurônios DA mesencéfalo podem ser divididos em três sistemas distintos de projeção anatômica e funcionalmente: mesostriatal, mesolímbico, e caminhos mesocorticais 2,5. A via nigroestriatal está envolvida no comportamento do motor, as vias mesolímbica desempenhar um papel importante no reforço, a motivação, aprendizagem e, ao passo que as vias dopaminérgicas que se projectam para o córtex pré-frontal estão implicados na cognição 2.

Neurônios DA estão envolvidos em diversas doenças neurológicas humanas, como a esquizofrenia, déficit de atenção, transtorno de hiperatividade, e doença de Parkinson (DP) de 2,4. A DP é caracterizada por uma degeneração progressiva e selectiva dos neurónios DA ligar substantia nigrapars compacta (SNC) para o estriado. A perda de Nigro-estriatal da neurônios resulta na depleção de dopamina no corpo estriado grave que é responsável de os sintomas motores da DP (bradicinesia, tremor de repouso, rigidez e) 7. A causa inicial da DP idiopática não foi estabelecida e os tratamentos atuais são apenas sintomático, com o objetivo de restaurar o nível de dopamina no corpo estriado. A droga mais prescrita é L-Dopa (Levodopa), o precursor natural da dopamina. Embora a administração de Levodopa compensa a perda de dopamina por um certo tempo, complicações motoras ocorrer após tratamentos de longa duração (discinesia e liga / desliga estados) 8,9.

Pesquisa sobre neurônios dopaminérgicos e PD está em progressão constante e estão sendo feitos intensos esforços para desenvolver tratamentos baseados em transplante de células, a terapia gênica, ou agentes neuroprotetores 10,11. No entanto, um grande problema permanece não elucidado: o que é a causa da extrema vulnerability de neurônios DA? Parte da resposta pode ser encontrada na actividade dos neurónios DA. A redução da atividade elétrica e da excitabilidade dos neurônios de DA parece aumentar sua propensão a se degenerar 12. No entanto, a complexidade do PD patogênese requer mais estudos para identificar os mecanismos envolvidos na degeneração de neurônios DA 13-15.

As culturas primárias são especialmente relevantes para estudar propriedades DA neurônio 16-19 e desafiar esses neurônios para várias tensões para avaliação de agentes neuroprotetores 20-24. Modelos de rato de cultura são os mais frequentemente utilizados, como a dissecação do mesencéfalo de embriões de rato é mais fácil, em comparação com o rato, e maiores quantidades de neurónios podem ser obtidos na ratazana. No entanto, a geração de modelos transgênicos da doença 25 aumentou consideravelmente o interesse da comunidade neurocientista para culturas primárias do rato 26-29. Embora a cultura da prepared de animais recém-nascidos podem ser utilizados, é preferível prepará-los a partir de embriões na fase de pós-mitótico (E13.5 mesencéfalo de neurónios), quando os neurónios mantiveram a sua capacidade de se diferenciar. O protocolo a seguir apresenta os neurónios do mesencéfalo isoladas em cultura primária a partir de embriões de rato (E13.5), as quais são as mais difíceis de preparar. Nomeadamente, é proporcionado um protocolo utilizando meio de cultura isento de soro para uma melhor reprodutibilidade. As duas etapas mais críticas na preparação cultura (dissecção e dissociação mecânica) será cuidadosamente detalhado no vídeo associado.

Protocol

Os ratos utilizados neste trabalho foram atendidas e tratadas de acordo com as diretrizes do Conselho da União Europeia (86/609 / UE) para o uso de animais de laboratório. 1 Preparação de soluções necessárias Soluções de Stock 10x de poli-L-ornitina (PLO) Solução: pesam-se 10 mg de bromidrato de PLO (peso molecular = 30,000-70,000) e dissolver em 70 ml de água estéril. Filtra-se a solução com uma seringa de filtro de 0,2 um, alíquota, e armazenar a -20 ° …

Representative Results

Um fluxograma que ilustra os passos de cultura de mesencéfalo é mostrado na Figura 1. Resumidamente, após a recolha de embriões a partir de um rato E13.5 Swiss grávida, mesencéfalo ventral é dissecado a partir de todo o embrião. Os fragmentos isolados do cérebro são submetidos sucessivamente a digestão enzimática e dissociação mecânica. As células dissociadas foram sedimentadas por centrifugação, ressuspensas em meio de cultura e semeados em placas de 12 ou de 24 poços pré-revestidos…

Discussion

Este protocolo apresenta os procedimentos e reagentes necessários para a preparação de uma cultura primária de neurónios do mesencéfalo do rato embrionário e o procedimento para a detecção de imunofluorescência neurónios dopaminérgicos. As etapas críticas do processo são a dissecção dos embriões ea dissociação mecânica dos fragmentos cerebrais coletados. Instrumentos de dissecção de alta qualidade ajuda a dominar a técnica de dissecação. Neurónios DA constituem uma pequena percentagem do mesenc…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Supported by grants from CNRS and INSERM. PM acknowledges support from the Fondation pour la Recherche Médicale en France (Equipe FRM 2009). SC acknowledges support from the Fondation de France.

Materials

Fetal Bovine Serum Lonza 14-801F
DMEM 4.5g/L Glucose with L-Glutamine Lonza BE12-604F
0.05% Trypsin-EDTA (1X), Phenol Red  Life Technologies 25300-054
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Life Technologies 15140122
L-glutamine, 200 mM Solution Life Technologies 25030123
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich  D8537
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham Sigma-Aldrich  D0547 Powder
Laminin – 1 mg/mL in Tris buffered NaCl Sigma-Aldrich  L2020
Poly-L-Ornithine hydrobromide Sigma-Aldrich  P3655
Insulin from porcine pancreas Sigma-Aldrich  I5523
apo-Transferrin human Sigma-Aldrich  T1147
Putrescine dihydrochloride Sigma-Aldrich  P5780
Progesterone Sigma-Aldrich  P8783
Sodium selenite Sigma-Aldrich  S5261
HEPES Sigma-Aldrich  H4034 
Glycine Sigma-Aldrich  G7126 Stock solution 1M in water
Gelatin Sigma-Aldrich  G9391 Stock solution 2% (w/v) in water
Triton X-100 Sigma-Aldrich  T8532
Paraformaldehyde 16% in water Electron Microscopy Sciences RT 15710-S
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) Merck Millipore 106329
D(+)-Glucose, Monohydrate Merck Millipore 4074-2
Hydrochloric acid – c(HCl) = 1 mol/l (1 N) Titripur Merck Millipore 109057
Sterile water – Aqua B. Braun Braun
Ethanol absolute NORMAPUR analytical reagent VWR 20821.321
Sterile Petri Dishes VWR 82050-566
Pasteur pipettes plain glass – Wilhem Ulbrich GdbR. VWR 612-2297
Counting chamber Malassez VWR 631-0975
Serum Acrodisc Syringe Filter with Supor Membrane, Sterile, GF/0.2 µm, 37 mm PALL Life science 4525
Surgical Scissors – Straight, sharp-sharp, 14.5 cm long Fine Science Tools 14002-14 To open the abdominal wall
Scissors – Straight, pointed, delicate, 10 cm long MORIA 4877A To open the uterine wall
Forceps – Curved, usual, serrated jaws 1 mm MORIA 2183 To manipulate embryos
Vannas Scissors – Curved, pointed, 7 mm blades MORIA MC50 To take out the mesencephalon
Ultra Fine Forceps – Curved, delicate, 13 cm long MORIA 9987 To remove meninges
BD BioCoat Poly-D-Lysine 24-well Multiwell Plates BD Bioscience 356414
BD Falcon 12-well Cell Culture Plate, flat-bottom with lid BD Bioscience 353043
SuperFrost Microscope Slides, Ground edges 90º MENZEL-GLÄSER AG00008032E
Precision cover glasses thickness No. 1.5H circular 18 mm Ø MARIENFELD 117580
Polyclonal Rabbit Anti-Microtubule-Associated Protein 2 (MAP2) Antibody Chemicon Millipore AB5622 1/200
Monoclonal Mouse Anti-Glutamate Decarboxylase (GAD67) Antibody, clone 1G10.2 Chemicon Millipore MAB5406 1/400
Monoclonal Rat Anti-Dopamine Transporter (DAT) Antibody, clone DAT-Nt  Chemicon Millipore MAB369 1/500
Monoclonal Mouse Anti-5-HT Antibody 1/8,000 – Generous gift from Yves Charnay (Swizerland, Yves.Charnay@hcuge.ch)
Goat Serum, New Zealand Origin Life Technologies 16210-064
Alexa Fluor 405 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody Life Technologies A-31556 1/200
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody Life Technologies A-11001 1/1000
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rat IgG (H+L) Antibody Life Technologies A-11007 1/1000
VECTASHIELD HardSet Mounting Medium Vector Laboratories H-1400
Stereomicroscope Carl Zeiss microscopy Stemi-2000C
Bunsen Burner FIREBOY VWR 451-0136

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記事を引用
Gaven, F., Marin, P., Claeysen, S. Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons. J. Vis. Exp. (91), e51751, doi:10.3791/51751 (2014).

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