造血干细胞和祖细胞(HSPCs)和骨髓龛之间的相互作用的性质知之甚少。定制的硬件修改和多步获取协议允许使用双光子共焦显微术图像体外骨髓区域内驻留标记HSPCs,跟踪相互作用和运动。
通过静止和增殖,自我更新和分化产生子代之间的微妙平衡,造血干细胞(HSCs)维护所有成熟的血细胞谱系的营业额。导致特定的HSC命运的复数信号的协调依赖于造血干细胞和复杂的骨髓微环境,其仍知之甚少[1-2]之间的相互作用。
我们描述了如何通过新开发的试样保持器相结合的稳定的动物的定位与多步共聚焦和双光子中的体内成像技术,可以得到含有HSPCs高分辨率三维堆叠和其周围的壁龛,并监测它们随着时间的推移通过多点时间推移成像。高清晰度成像可检测离体标记的造血干细胞和祖细胞(HSPCs)驻留在骨髓内。此外,多点时间推移三维成像,邻btained更快的采集设置,提供了HSPC运动和HSPCs和基质细胞之间的相互交流准确的信息。
HSPCs相对于GFP阳性成骨细胞跟踪被示为这种方法的一个示例性应用。这种技术可以用来跟踪鼠标颅盖骨的骨髓空间内的感兴趣的任何适当标记的造血细胞或间质细胞。
尽管已认识到了几十年3干细胞小生境和良好表征在许多组织中,如嗅球,肌纤维,毛囊膨出或CNS脑室下区4-7,(造血干细胞(HSCs)和骨髓微环境之间的相互作用BM)仍然很差,由于直接观察穿过骨单个细胞以及组织本身的极流体性质的难度理解。已经表明,通过一些功能性研究的基础上烧蚀或过度表达在任造血干细胞或微环境本身的基质细胞的特异性基因,即不同类型的细胞和调节信号的一个复杂的网络,负责调节静止之间微妙的平衡,增殖,扩张和造血干细胞1-2分化。造血干细胞和它们的生态位之间的串扰可以只通过直接观察来理解深度。这是ACHievable得益于先进的成像方案的发展,不仅在显微镜方面相结合的可利用的技术,也是试样夹持器的解决方案和采集软件。
中的小鼠颅盖骨的骨髓移植室的造血干细胞和祖细胞(HSPCs)的单细胞分辨率的实时成像显示,移植HSPCs定位中的SDF-1和VCAM-1-阳性血管8-9附近,并有更多的未成熟细胞从GFP阳性成骨细胞样细胞(Col2.3-GFP转基因小鼠品系,其中成骨细胞受限制的胶原蛋白1α启动子驱动GFP的表达),而它们的后代是更远端10 20微米-在15个被发现。类似的观察从解剖和股骨骨折的骨头11和薄tibeal骨头12获得。颅骨骨髓成像仍然是最侵入性的方式来实现HSPCs内日直视EIR原生微环境。
任何活体标本成像有一种内在的需要,以保持样品尽可能保持平稳,以避免任何不必要的文物由于样品运动。呼吸会导致鼠标头部的摆动运动,它需要避免成像颅骨骨髓的时候。传统的立体人,例如用于脑成像和电,不适合颅骨成像,因为它们阻碍了额骨。从使用,以尽量减少在现场的成像和电生理研究13窘迫鼠标座开始,2架组件开发,用一小片固定在鼠标的头部打造成像窗口连接到一个更大的手臂,确保稳抓稳了沉重的底板,它牢牢地固定到显微镜阶段。固定磁头片的小鼠的颅骨允许自由呼吸,同时仍然固定磁头就位并充分消除米ovements因呼吸。 A“锁和钥匙”的机制,连接头部件在支架体可在窗口的尺寸被最小化,以及定位的高精度化,因此,简化了外科手术,并且在合适的基片的插入阶段允许对在显微镜精确对准。准确地监测游动细胞,多点时间推移协议被设计为允许细胞的跟踪随时间的时间点之间的间隔5分钟。在这里,做标记的造血干细胞被注射到col2.3GFP osteoblasitc记者小鼠10,14和拍摄约20小时后。该设计并经过一段多个小时来执行快速多点延时的同一区域的成像所需要的成像设置的详细描述鼠标支架。
是什么成就?
该协议采用延时多维成像流式细胞仪监测在小鼠颅骨骨髓移植纯化, 体外标记,移植HSPCs。单移植细胞的识别已经达到,这些都被监视的多的时间(hr)高精确度延长周期。呼吸引起的运动伪影被最小化,细胞已被多次重新制作映像在较长的时间过程。
什么是未来的发展方向?
该技术的发展可以向回收实验的进展,以便为成像在多天里,在一个星期或更长时间,并利用气体麻醉剂如异氟醚的过程中,缩短和简化了回收过程的小鼠(注:回收实验要求严格无菌手术条件和适当的止痛药局)。开发elopment较大的彩色调色板体内染料以及造血细胞的有效的遗传标记也将促进多标记实验中,提供更深入骨髓内的细胞-细胞相互作用,并允许在未来更复杂的实验。此外,多个骨髓结构和间质成分的同时标示将提供正在发生的HSPC龛事件更完整的画面。的时间推移电影图像稳定性可以通过稳定的显微镜进一步以及减小了温度梯度的样品和购买后在通过使用图像配准算法可以提高预采集。
限制 :
记载的技术提出了一些限制。小鼠以下注射麻醉剂的施用生存是不可预测的,这是很容易经历并发症取决于个别响应麻醉剂。通常,成像会话的时间越长,就越难是鼠标从麻醉中恢复,并且因此重要的是要仔细规划鼠标是否要回收,最好限制时间推移成像持续时间。使用注射麻醉药限制时间每个成像会议可以持续。虽然可以通过readministering较小剂量的麻醉剂,以延长麻醉时,难以执行这种精确和过量鼠标的过早终止的体内成像的最常见的原因之一。气体麻醉是毒性较低,并且允许更长的初始成像会话,但是快速的鼠标恢复后> 2小时长的异氟醚的施用很少成功。该技术的另一个限制是,可以在多点延时成像而获得,由于需要快速获取图像的图像的分辨率有限。这一点,再加焦点漂移或现场跳(光盘上述ussed),可以使细胞追踪困难。
用另一种方法比较:
HSPCs通常标有亲脂性染料一样,但尔和的DiI染料是等效的替代品和其他细胞的染料可以使用,只要足够亮,如在[16]点评。即使细胞的离体标记与DID已经显示出不影响造血干细胞的长期作用,它具有在细胞分裂稀释该DID的限制(或任何其它化学染料)。自造血干细胞在移植后的最初几天增殖,信号噪声比为这些细胞迅速劣化。细胞的遗传操作和荧光蛋白的表达的手段内源性标记是一种可行的替代方法,只要在荧光蛋白的表达在足够高的水平,以产生可检测的信号通过颅骨。有许多的替代技术部历史可iques到骨髓的空间内执行HSPCs成像,每个都有自己的优点和局限性。光纤为基础的成像器件允许插入骨髓重建的长骨[8]成像,而激光共聚焦成像下面的胫骨和牙釉质变薄了手术钻头手术暴露[12]所产生的HSPCs居住在详细图像长骨的周缘区域。然而这些方法都远比这里描述并且因此不允许重复成像会议集中于同一小鼠在相同的骨髓区域一个更侵入。此外,它是可能的,这些技术可能会影响观察到的给予在周围组织中广泛损害不可避免的响应的细胞。 HSPCs已经成像为很短的时间,通过放置在切下,裂隙股骨[11]盖玻片,这种恶劣的HSPCs的组织制备的但是影响不是CLEAr和技术被用来唯一地获取单个时间点的观测。固定骨头已经划分成连续切片,染色,所获得的图象重建为3D模型,从而提供优良的三维分辨率,尤其是当血管铸件使用[17],以及最近的激光扫描仪(法援局)已被用来获得定量关于HSPCs 在原地措施,强调了免疫组化[18],但无法提供有关的细胞行为的任何时间信息。在这种新技术所描述的技术提供了良好的分辨率在3D,足够时间采样的组合在4D监测细胞和它们相对非侵入性,因此提供了一个理想的方法,以达到长期监测HSPCs与骨髓互动微环境。
The authors have nothing to disclose.
成像进行了一个堂堂正正的徕卡SP5共聚焦显微镜位于伦敦帝国学院的电影工厂,由马丁·Spitaler博士管理的范围内。
试样夹持器和头盔是在与英国伦敦帝国学院的化学工程系合作,与意见塞缪尔·琼斯和西蒙·舒尔茨博士。
尼古拉Ruivo,弗朗西斯科·迪亚兹和哥伦比亚广播公司的工作人员在国子监是有助他们对小鼠饲养援助和咨询。 马克·斯科特资助HFSP和电影,Olufolake Akinduro由CRUK和克里斯蒂娜罗塞尔索由CRUK,KKLF,BBSRC和HFSP。
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Ketamine(Narketan 100mg/ml) | Vetoquinol | 407575 0107 C | Other anesthetics may be used in place of this. |
Medetomidine(Domitor 1mg/ml) | Elanco | 134800-2 | Other analgesics may b used in place of this. |
Vibrant DiD cell labeling solution | Roche Products Ltd. | V22887 | Other colors are available and may be used if required. |
Lacrilube ophtalmic ointment | Allergan | n/a | avaliable by prescription by the local vet |
Kemdent "Diamond Carve" glass ionomer cement | Associated Dental Products Ltd. via Kemdent | SUN527 | We use shade A3, but any shade of cement can be used. |
PBS | multiple equivalent | n/a | |
Sterile water | multiple equivalent | n/a | |
Insulin syringes | Terumo Medical Corporation | SS10M3109 | 1mL, 31G |
Mouse restrainer | Harvard Apparatus | 340031 | Cone type (small) |
Autoclaved forceps and scissors | Agar Scientific | AGT577 AGT5034 |
Iris scissors – 90mm; Dumont HP tweezers (0.06mm tip) |
Weigh boat and cement stirrer | VWR | 611-1996/231-0370 | 5mL weigh-boat (black)/ Wooden tongue depressor |
Leica SP5 upright confocal microscope with motorized stage and two-photon laser | Leica Microsystems | Not available | Call for quote |
25x water dipping objective lens (N.A. = 0.95) | Leica Microsystems | 11506323 | HCX IRAPO L lens |
Custom designed mouse holder | Imperial College Engineering Workshop | N/A | See Figure 1 for details |
Heating pad with rectal thermometer probe | BASi Instrumentation | FHC-40902/ FHC-40908/ FHC-4090502 | Heat mat/ Control box/ Thermometer probe |