في فيفو تتبع 4 الأبعاد للالجذعية المكونة للدم والسلف الكبار في خلايا الفأر قبي نخاع العظم
概要
هناك سوء فهم لطبيعة التفاعلات بين الخلايا المكونة للدم الجذعية والسلف (HSPCs) ومحاريب نخاع العظام. التعديلات الأجهزة المخصصة وبروتوكول اكتساب متعددة الخطوات تسمح باستخدام اثنين من الفوتون والفحص المجهري متحد البؤر لصورة فيفو السابقين HSPCs المسمى المخزن داخل المناطق نخاع العظام، وتتبع التفاعلات والحركة.
Abstract
من خلال التوازن الدقيق بين هدوء وانتشار، وتجديد الذات وإنتاج ذرية متباينة، والخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) الحفاظ على دوران الأنساب جميع خلايا الدم الناضجة. تنسيق الإشارات المعقدة التي تفضي إلى مصائر شهادة الثانوية العامة المحددة يعتمد على التفاعل بين HSCs ومعقدة المكروية نخاع العظام، التي لا تزال غير مفهومة [1-2].
ونحن تصف كيف من خلال الجمع بين حامل العينة وضعت حديثا لتحديد المواقع الحيوانات مستقرة مع متعددة الخطوات متحد البؤر والفوتون اثنين في تقنيات التصوير الجسم الحي، فمن الممكن الحصول على مداخن 3D عالية الدقة تحتوي على HSPCs والمنافذ المحيطة بها ورصد لهم على مر الزمن من خلال متعددة نقطة الوقت الفاصل بين التصوير. تصوير عالية الوضوح يتيح الكشف عن فيفو السابقين الخلايا الجذعية المكونة للدم والسلف المسمى (HSPCs) المقيمات داخل نخاع العظام. وعلاوة على ذلك، متعددة نقطة الوقت الفاصل بين التصوير 3D، سbtained مع إعدادات اقتناء أسرع، ويوفر معلومات دقيقة عن حركة HSPC والتفاعلات المتبادلة بين HSPCs وخلايا سدى.
ويظهر من تتبع HSPCs فيما يتعلق GFP الخلايا بانية العظم إيجابي كتطبيق المثالي لهذه الطريقة. ويمكن استخدام هذه التقنية لتتبع أي المسمى بشكل مناسب للدم أو انسجة الخلايا المصالح داخل الماوس القبة مساحة النخاع العظمي.
Introduction
على الرغم من محاريب الخلايا الجذعية بعد أن تم الاعتراف منذ عقود 3 وتتميز في العديد من الأنسجة بشكل جيد مثل البصلة الشمية، ألياف العضلات، وبصيلات الشعر أو انتفاخ CNS منطقة subventricular 4-7، والتفاعلات بين الخلايا المكونة للدم الجذعية (HSCs) ونخاع العظام المكروية ( BM) لا تزال غير مفهومة نظرا لصعوبة مراقبة مباشرة الخلايا واحد من خلال العظام وكذلك طبيعة السوائل للغاية من الأنسجة نفسها. فقد تبين، من خلال عدد من الدراسات وظيفية على أساس ablating أو overexpressing جينات معينة في أي HSCs أو الخلايا اللحمية من المكروية نفسها، أن شبكة معقدة من أنواع مختلفة من الخلايا وإشارات التنظيمية هي المسؤولة عن تنظيم التوازن الدقيق بين هدوء والانتشار والتوسع وتمايز HSCs 1-2. الحديث المتبادل بين HSCs والمنافذ التي يمكن فهمها بعمق إلا من خلال الملاحظة المباشرة. هذا هو منظمة العمل ضد الجوعبفضل ievable في تطوير بروتوكولات التصوير المتقدمة، والجمع بين التكنولوجيا المتاحة ليس فقط من حيث المجهري، ولكن أيضا من الحلول حامل العينة والبرمجيات الاستحواذ.
أظهر قرار وحيد الخلية الحية التصوير من الخلايا المزروعة الجذعية المكونة للدم والسلف (HSPCs) في حجرة BM العظام calvaria الفأر الذي HSPCs engrafting توطين في القرب من السفن SDF-1 وVCAM-1-ايجابية 8-9 وأن الخلايا غير الناضجة أكثر وتوجد داخل 15-20 ميكرون من خلايا بانيات العظم GFP إيجابية (Col2.3-GFP خط الماوس المعدلة وراثيا، الذي المقيدة بناء العظم الكولاجين 1α المروج يقود GFP التعبير)، في حين ذريتهم هي أكثر البعيدة 10. تم الحصول على ملاحظات مماثلة من تشريح وكسور عظام الفخذ و11 من عظام ضعيفة tibeal 12. لا يزال التصوير من نخاع العظام قبة القحف نهج أقل الغازية لتحقيق رؤية مباشرة من داخل HSPCs عشرمجلة إكزكتف إنتلجنس ريفيو المكروية الأصلية.
مع أي التصوير العينة الحية هناك حاجة ملازمة للحفاظ على عينة كما لا يزال ممكن لتجنب أي لا لزوم لها القطع الأثرية بسبب حركة العينة. التنفس يسبب حركات متذبذبة من الرأس الماوس، والتي تحتاج إلى تجنبها عند التصوير نخاع العظام قبة القحف. أصحاب المجسم التقليدية، وتستخدم على سبيل المثال لتصوير الدماغ والكهربية، ليست مناسبة للتصوير القبة لأنها تعرقل العظام الأمامية. بدءا من حامل الماوس تستخدم لتقليل الشدة أثناء التصوير والكهربية الدراسات الحية 13، وقد وضعت حامل 2 عنصر، مع قطعة صغيرة ثابتة في الرأس من الماوس لخلق نافذة التصوير متصلة الذراع أكبر ضمان عقد ثابت مع لوحة قاعدة الثقيلة التي يؤمن بقوة في مرحلة المجهر. تأمين قطعة الرأس إلى الجمجمة من الفأرة يتيح حرية التنفس في حين لا يزال شل حركة الرأس في مكان والقضاء على نحو كاف مovements بسبب التنفس. آلية "القفل والمفتاح" الذي يربط الرأس قطعة للجسم حامل تسمح حجم النافذة ليكون الحد الأدنى فضلا عن زيادة دقة تحديد المواقع، وبالتالي تبسيط عملية جراحية، ونوبة من لوحة قاعدة في مرحلة يسمح للمحاذاة دقيقة على المجهر. لمراقبة بدقة خلايا متحركة، تم تصميم متعدد نقطة بروتوكول الفاصل الزمني للسماح تتبع الخلايا مع مرور الوقت 5 دقائق الفاصلة بين النقاط الزمنية. يتم حقن HSCs هنا، هل وصفت في col2.3GFP osteoblasitc الفئران مراسل 10،14 وبعد تصوير حوالي 20 ساعة. صاحب الماوس التي تم تصميمها ويتم وصف إعدادات التصوير المطلوبة لأداء سريع متعدد نقطة الوقت الفاصل بين التصوير من نفس المناطق على مدى ساعة متعددة بالتفصيل.
Protocol
Representative Results
Discussion
ما تم انجازه؟
يستخدم بروتوكول التصوير متعدد الأبعاد الوقت الفاصل بين لمراقبة هجرة FACS تنقيتها، خارج الحي المسمى، HSPCs زرعها في الماوس قبة القحف نخاع العظام. وقد تحقق تحديد الخلايا المزروعة واحدة تم رصدها هذه على مدى فترات طويلة من الزمن (ساعة) مع دقة عالية. تم التقليل من التحف حركة التنفس الناجم وتم reimaged خلايا مرارا وتكرارا على مدى فترة زمنية بالطبع لفترة طويلة.
ما هي التوجهات المستقبلية؟
تطوير تقنية يمكن إحراز تقدم نحو التجارب الانتعاش للسماح للتصوير في أيام متعددة، على مدار أسبوع أو أكثر واستخدام التخدير الغاز مثل الأيزوفلورين لاختصار وتبسيط عملية الانتعاش للماوس (ملاحظة: التجارب الانتعاش تتطلب بدقة شروط الجراحة المعقمة وإدارة المسكنات المناسبة). ديفelopment من أكبر لوحة الألوان من الأصباغ في الجسم الحي وكذلك وضع العلامات الوراثية كفاءة الخلايا المكونة للدم أيضا سيسهل التجارب متعددة العلامات، وتوفير مزيد من التبصر في التفاعلات خلية خلية داخل نخاع العظام والسماح لتجارب أكثر تعقيدا في المستقبل. بالإضافة إلى ذلك، فإن وضع العلامات في وقت واحد من عدة هياكل نخاع العظام ومكونات سدى توفر صورة أكثر اكتمالا للأحداث التي تجري في محاريب HSPC. استقرار الصورة من الأفلام مرور الزمن يمكن تحسين preacquisition عن طريق تثبيت المجهر مزيد فضلا عن التقليل من التدرجات درجة الحرارة في العينة وpostacquisition باستخدام خوارزميات تسجيل الصورة.
القيود:
تقنية الموضحة تقدم بعض القيود. بقاء الفئران التالية إدارة التخدير عن طريق الحقن لا يمكن التنبؤ بها وأنه من السهل جدا لمضاعفات خبرة اعتمادا على استجابة الفرد للمخدر. عموما، وتعد جلسة التصوير، وصعوبة هو الماوس للتعافي من التخدير ولذلك فمن المهم أن تخطط بعناية ما إذا كان الماوس لاستردادها، مما يحد بشكل مثالي مدة انقضاء وقت التصوير. استخدام التخدير عن طريق الحقن يحد من الوقت كل دورة التصوير يمكن أن تستمر ل. في حين أنه من الممكن إطالة التخدير بواسطة readministering جرعة صغيرة من المخدر، فمن الصعب إجراء هذا بدقة وجرعة زائدة الماوس هو واحد من الأسباب الأكثر شيوعا من السابق لأوانه إنهاء التصوير في الجسم الحي. التخدير الغاز هو أقل سمية ويسمح لجلسة التصوير تعد الأولية، ولكن الانتعاش السريع من الفأرة بعد> 2 ساعة إدارة طويلة من الأيزوفلورين نادرا ما تكون ناجحة. تقييد آخر للتقنية هو القرار محدود من الصور التي يمكن الحصول عليها خلال متعددة نقطة التصوير مرور الزمن، بسبب ضرورة الحصول على الصور بسرعة. هذا، إلى جانب الانحراف البؤري أو الحقل يقفز (القرصussed أعلاه)، يمكن أن تجعل من الصعب تتبع الخلايا.
مقارنة مع الطرق البديلة:
وعادة ما وصفت HSPCs مع صبغ محبة للدهون فعلت، ولكن دير والجاذبة الأصباغ هي البدائل تعادل والأصباغ خلية أخرى يمكن استخدامها طالما مشرق بما فيه الكفاية، كما استعرضت في [16]. على الرغم من خارج الحي وسم الخلايا مع DID وقد تبين أن لا يؤثر على وظيفة على المدى الطويل HSCs، فمن لديه الحد الذي لم (أو أي صبغة كيميائية أخرى) والمخفف على انقسام الخلايا. منذ HSCs تتكاثر خلال الأيام الأولى بعد زرع، إشارة إلى نسبة الضوضاء لهذه الخلايا تتدهور بسرعة. وضع العلامات الذاتية للخلايا عن طريق التلاعب الجيني والتعبير عن البروتينات الفلورية هو طريقة بديلة قابلة للحياة، طالما يتم التعبير عن البروتينات الفلورية عند مستويات مرتفعة بما فيه الكفاية لتوليد إشارة اكتشافها من خلال عظم الجمجمة. هناك عدد من ميتاليك بديلiques متوفرة لتنفيذ تصوير HSPCs داخل الفضاء نخاع العظم، ولكل منها فوائدها الخاصة والقيود. إدخال أجهزة التصوير القائم على الألياف البصرية يسمح للتصوير من نخاع العظم في إعادة تشكيل العظام الطويلة [8]، في حين أن التصوير متحد البؤر بعد التعرض الجراحية من الساق وترقق العظام مع المينا الحفر الجراحية [12] ينتج صورا تفصيلية من المقيمين في HSPCs المناطق الطرفية من العظام الطويلة. ولكن هذه الأساليب هي أكثر الغازية بكثير من وصفها هنا، وبالتالي لا تسمح لتكرار جلسات التصوير مع التركيز على المنطقة نفسها نخاع العظم داخل نفس الماوس. وعلاوة على ذلك، فمن الممكن أن هذه التقنيات قد تؤثر على خلايا احظ نظرا للاستجابة حتمية لأضرار واسعة النطاق في الأنسجة المحيطة بها. تم تصوير HSPCs لفترات قصيرة من الزمن من خلال coverslips وضعت على رفعه، كسور عظام الفخذ [11]، ولكن تأثير هذا المستحضر قاسية من النسيج على HSPCs ليس جزءا لا يتجزأ منوقد استخدم r و تقنية فريدة للحصول على نقطة واحدة الملاحظات الوقت. تم مقطوع العظام الثابتة إلى أقسام التسلسلية، الملون، والصور التي تم الحصول عليها بناؤها إلى نموذج 3D، وتوفير قرار 3D ممتازة، وخصوصا عندما تستخدم يلقي الأوعية الدموية [17]، واستخدمت مؤخرا الليزر الضوئي الخلوي (LaSC) للحصول على الكمية تدابير حول HSPCs في الموقع، أبرز بواسطة المناعية [18] ولكن غير قادر على تقديم أي معلومات الزمانية حول سلوك الخلايا. التقنيات الموضحة في هذه التقنية الجديدة توفر مزيجا من قرار جيد في 3D، وأخذ العينات الزمنية كافية لرصد الخلايا في 4D وهي نسبيا غير الغازية، وبالتالي تقديم نهج المثالي لتحقيق رصد طويل الأجل من HSPCs التفاعل مع نخاع العظام المكروية.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأجري التصوير من على رأسي لايكا SP5 المجهر متحد البؤر التي تقع داخل منشأة FILM من امبريال كوليدج في لندن، الذي يديره الدكتور مارتن Spitaler.
وقدم صاحب العينة وخوذة بالتعاون مع قسم الهندسة الكيميائية من كلية امبريال لندن، بمشورة من صمويل جونز والدكتور سيمون شولتز.
كان نيكولا Ruivo، فرانسيسكو دياز والموظفين CBS في كلية امبريال فعال لما قدموه من مساعدة والمشورة بشأن تربية الماوس. يتم تمويل كافة سكوت بواسطة HFSP وFILM، Olufolake Akinduro بواسطة CRUK وكريستينا لو سيلسو بواسطة CRUK، KKLF، BBSRC وHFSP.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Ketamine(Narketan 100mg/ml) | Vetoquinol | 407575 0107 C | Other anesthetics may be used in place of this. |
| Medetomidine(Domitor 1mg/ml) | Elanco | 134800-2 | Other analgesics may b used in place of this. |
| Vibrant DiD cell labeling solution | Roche Products Ltd. | V22887 | Other colors are available and may be used if required. |
| Lacrilube ophtalmic ointment | Allergan | n/a | avaliable by prescription by the local vet |
| Kemdent "Diamond Carve" glass ionomer cement | Associated Dental Products Ltd. via Kemdent | SUN527 | We use shade A3, but any shade of cement can be used. |
| PBS | multiple equivalent | n/a | |
| Sterile water | multiple equivalent | n/a | |
| Insulin syringes | Terumo Medical Corporation | SS10M3109 | 1mL, 31G |
| Mouse restrainer | Harvard Apparatus | 340031 | Cone type (small) |
| Autoclaved forceps and scissors | Agar Scientific | AGT577 AGT5034 |
Iris scissors – 90mm; Dumont HP tweezers (0.06mm tip) |
| Weigh boat and cement stirrer | VWR | 611-1996/231-0370 | 5mL weigh-boat (black)/ Wooden tongue depressor |
| Leica SP5 upright confocal microscope with motorized stage and two-photon laser | Leica Microsystems | Not available | Call for quote |
| 25x water dipping objective lens (N.A. = 0.95) | Leica Microsystems | 11506323 | HCX IRAPO L lens |
| Custom designed mouse holder | Imperial College Engineering Workshop | N/A | See Figure 1 for details |
| Heating pad with rectal thermometer probe | BASi Instrumentation | FHC-40902/ FHC-40908/ FHC-4090502 | Heat mat/ Control box/ Thermometer probe |
参考文献
- Lo Celso, C., Scadden, D. T. The Hematopoietic Stem Cell Niche at a Glance. J Cell Sci. 124 (Pt 21), 3529-3535 (2011).
- Wang, L. D., Wagers, A. J. Dynamic Niches in the Origination and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (10), 643-655 (2011).
- Schofield, R. The Relationship Between the Spleen Colony-forming Cell and the Hematopoietic Stem Cell. Blood Cells. (1-2), 7-25 (1978).
- Bischoff, R. Interaction Between Satellite Cells and Skeletal Muscle Fibers. Development. 109 (4), 943-952 (1990).
- Cotsarelis, G., Sun, T. T., Lavker, R. M. Label-retaining Cells Reside in the Bulge Area of Pilosebaceous Unit: Implications for Follicular Stem Cells, Hair Cycle, and Skin Carcinogenesis. Cell. 61 (7), 1329-1337 (1990).
- Doetsch, F., Caillé, I., Lim, D. A., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Subventricular Zone Astrocytes are Neural Stem Cells in the Adult Mammalian Brain. Cell. 97 (6), 703-716 (1999).
- Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Measuring Calcium Signalling Using Genetically Targetable Fluorescent Indicators. Nature Protocols. 1 (3), 1057-1065 (2006).
- Lewandowski, D., et al. In vivo Cellular Imaging Pinpoints the Role of Reactive Oxygen Species in the Early Steps of Adult Hematopoietic Reconstitution. Blood. 115 (3), 443-452 (2010).
- Sipkins, D. A., et al. In vivo Imaging of Specialized Bone Marrow Endothelial Microdomains for Tumour Engraftment. Nature. 435 (7044), 969-973 (2005).
- Lo Celso, C., et al. Live-animal Tracking of Individual Haematopoietic Stem/Progenitor Cells in their Niche. Nature. 457 (7225), 92-96 (2009).
- Xie, Y., et al. Detection of Functional Haematopoietic Stem Cell Niche Using Real-time Imaging. Nature. 457 (7225), 97-101 (2009).
- Köhler, A., et al. Altered Cellular Dynamics and Endosteal Location of Aged Early Hematopoietic Progenitor Cells Revealed by Time-lapse Intravital Imaging in Long Bones. Blood. 114 (2), 290-298 (2009).
- Schultz, S. R., Kitamura, K., Post-Uiterweer, A., Krupic, J., Häusser, M. Spatial Pattern Coding of Sensory Information by Climbing Fibre-evoked Calcium Signals in Networks of Neighboring Cerebellar Purkinje Cells. J Neuroscience. 29 (25), 8005-8015 (2009).
- Lo Celso, C., Lin, C. P., Scadden, D. T. In vivo Imaging of Transplanted Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Mouse Calvarium Bone Marrow. Nat Protoc. 6 (1), 1-14 (2011).
- Lo Celso, C., Scadden, D. Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs). Journal of Visualized Experiments. (2), e157 (2007).
- Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, ., C, From Seeing to Believing: Labelling Strategies for in vivo Cell-tracking Experiments. Interface Focus. 3 (3), 20130001 (2013).
- Ellis, S. L., et al. The Relationship Between Bone, Hemopoietic Stem Cells and Vasculature. Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).
- Nombela-Arrieta, C., et al. Quantitative Imaging of Haematopoietic Stem and Progenitor Cell Localization and Hypoxic Status in the Bone Marrow Microenvironment. Nature Cell Biology. 15, 533-543 (2013).
