Здесь описано флуоресценции на основе кальций мобилизации анализ является средней пропускной способности обратной фармакологии система скрининга для идентификации функционально активирующего лиганда (ов) бесхозных G-белком рецепторов (GPCR).
На протяжении более 20 лет, обратная фармакология был выдающийся стратегии, чтобы обнаружить активирующих лигандов сирот G-белком (GPCR). Наступление обратной фармакологии анализа является клонирование и последующей трансфекции GPCR интереса к сотовой системе экспрессии. Гетерологичный выражена рецептор то вызов с соединением библиотеки лигандов-кандидатов для идентификации рецептор-лиганд активации (ы). Активация рецепторов можно оценить путем измерения изменений в концентрации молекул второй мессенджер репортера, как кальций или цАМФ. Флуоресценции основе кальция мобилизация анализа, описанного здесь, часто используется средне-пропускной обратная фармакология анализа. Сирота ХВГФ временно экспрессируется в эмбриональных почек 293T (HEK293T) клеток и беспорядочную половую жизнь Gα 16 конструкция является котрансфицируют. После связывания лиганда, активация Gα 16 субъединицы индуцирует высвобождение кальция фром эндоплазматической сети. До лиганда скрининга, клетки, экспрессирующие рецептор загружаются с флуоресцентным индикатором кальция, Fluo-4 ацетоксиметил. Флуоресцентный сигнал из Fluo-4 незначительна в клетках в состоянии покоя, но может быть усилен более чем в 100 раз при взаимодействии с ионами кальция, которые выбрасываются после активации рецептора. Описанная методика не требует много времени созданию стабильно трансфицированных клеточных линий, в которых трансфектированную генетический материал, интегрированных в геном клетки-хозяина. Вместо этого переходное трансфекции, создавая временную экспрессию гена-мишени, является достаточным для выполнения скрининге. Установка позволяет среднего скрининг сотен соединений. Совместной трансфекции в беспорядочном Gα 16, который соединен с большинством GPCRs, позволяет внутриклеточный сигнальный путь будет перенаправлен к выпуску кальция, независимо от нативного сигнального пути эндогенного брусчаткиIngs. В клетки HEK293T просты в обращении и доказали свою эффективность на протяжении многих лет в рецепторных deorphanization анализов. Тем не менее, оптимизация анализа на специфические рецепторы могут оставаться необходимо.
G-белком рецепторы (GPCR) составляют одну из крупнейших и наиболее диверсифицированных семей среди всех белков клеточной поверхности. Их присутствие в позвоночных, беспозвоночных, растения, дрожжи, и слизь плесень, а также в простейших и первой имеющий два зародышевых листка многоклеточные указывает, что GPCRs являются одними из старейших молекул, связанных с передачи сигнала 1. Их естественные активирующие лиганды включают в себя широкое разнообразие внешних раздражителей, включая пептиды, биогенные амины, отдушек, гликопротеинов и фотонов 2. Таким образом, эти системы сигнализации рецептор-лиганд участвуют в самых разнообразных физиологических процессов. Широкий Спектр устройств делает их идеально подходит для развития терапевтических препаратов, которые охватывают широкий спектр заболеваний человека. О 50-60% текущих лекарственных препаратов представлены GPCRs 3,4. Кроме того, их большое значение в фармацевтической промышленности, GPCRs также в центре внимания для развитияНовое поколение видоспецифичных инсектицидов 5,6 и пестицидов в целом. Поскольку естественные лиганды многих GPCRs еще неизвестный, они классифицируются как сирот GPCRs. Deorphanization этих рецепторов улучшит понимание их физиологической роли в организме и может раскрыть предполагаемые цели для новых приложений наркотиков 7.
С геномной эры, обратная стратегия фармакология широко применяется для deorphanization из GPCRs 8. Подход предполагает, что сиротский рецептор используется в качестве "крючок" до "рыба без 'ее активации лиганда с биологической экстракта или из библиотеки синтетических соединений. GPCR, представляющий интерес, поэтому клонировали и затем трансфицируют в сотовой системе экспрессии. В наиболее часто используемых методов, активация рецепторов определяют путем измерения изменений в концентрации молекул второго Messenger 9 </suр>. Основные скрининга рецепторов анализы полагаться на кальций-чувствительных биолюминесцентных белков (например, экворин) 10 или люминесцентные индикаторы кальция (например, флуо-4) 11. Флуоресцентные основе анализов, в которых рецептор-экспрессирующие клетки загружаются с флуоресцентным индикатором кальция до лиганда скрининга, имеют то преимущество, что они позволяют высокопроизводительного скрининга из-за их простоты использования, короткое время чтения, и гибкость скрининга несколько рецепторы сирот на одной пластине 12.
Здесь, флуоресценция на основе кальций мобилизации анализ тщательно описаны и проиллюстрированы в процессе deorphanization от Дрозофилы короткого нейропептида F (sNPF) рецепторов. Эта система сигнализации neuropeptidergic был первоначально характеризуется Мертенс и др.. в 2002 году 13 с биолюминесценции кальция анализа, проведенного в клетки яичника китайского хомячка (СНО)14 и Фэн и др.. В 2003 году с помощью электрофизиологического анализа с использованием Xenopus ооциты 15. Наличие системы сигнализации sNPF-видимому, ограничена к типу членистоногих, где она участвует в широком диапазоне процессов, включая регулирование подачи, роста стрессовых реакций, передвижения, и циркадных ритмов 16.
Исследование neuropeptidergic сигнальных систем насекомых может привести не только к новым целям для развития инсектицидов, но знание их функционирования могут быть также экстраполированы по отношению к другим организмам, как многие системы сигнализации в целом были хорошо сохраняющихся в ходе эволюции 17. В последнее десятилетие значительный прогресс был достигнут в процессе deorphanization насекомыми нейропептида GPCRs. Несмотря на эти усилия, лишь небольшое количество рецепторов были согласованы с их родственным лигандом, и множество информации о последовательности дляновые сироты GPCRs стала доступна благодаря бум геномики 18. Наличие средних / высокопроизводительного скрининга подходов, как флуоресценции основе кальция мобилизационной анализа, который оказался быть широко применяется методика 9,18, поэтому бесценны.
Флуоресценция на основе кальций мобилизации анализ, как описано здесь выполняется в человеческой эмбриональной почки 293T (HEK293T) клеточной линии и использует флуоресцентный зонд для определения изменений внутриклеточной концентрации кальция при активации рецептора. Чтобы гарантировать высокий уровень экспрессии и уровни перевод рецептора, консенсус последовательность Козака 19 добавляется к 5'-конца от кодирующей рецептор-последовательности, который впоследствии клонированного в вектор экспрессии (например, pcDNA вектор серии для клеточных линий млекопитающих). Как это трудно предсказать эндогенный G белок-сцепление-сироты GPCR на основе последовательности информацииодин, второй молекулы посыльного (например, кальция или цАМФ), которые модулированные после активации рецептора часто остаются неизвестными до идентификации лиганда. Чтобы обойти эту проблему, беспорядочные G белки семейства д G (например, мышиных Gα 15 или 16 человека Gα [используемого здесь]) или химерных белков G (например, Gα qi5), которые взаимодействуют с большинством GPCR, и вызывают высвобождение кальция может быть совместно выразили 20,21,22. После связывания лиганда с его рецептором, GPCR претерпевает конформационное изменение, которое приводит к активации специфических внутриклеточных путей. Гуанозин дифосфат (ВВП) молекула, обязаны в соответствии с покоящихся условиях в Gα 16 субъединицы, будет заменен на гуанозинтрифосфата (GTP) молекулы. Это провоцирует диссоциацию гетеротримерного G белка в Gα 16 и Gβγ субъединицы. Gα 16 субъединицы активирует фосфолипазу С &# 946; (PLCβ), который в свою очередь гидролизует мембраносвязанное фосфатидилинозитол бисфосфат (PIP 2) в результате диацилглицерина (DAG) и инозитол трифосфата (IP 3). ИП 3 будет распространяться по всей цитоплазме и активирует 3-зависимые IP кальциевых каналов, присутствующих в мембране эндоплазматической сети, который вызывает высвобождение кальция в цитоплазму.
Высвобождение кальция при активации рецепторов происходит в течение нескольких секунд и могут быть обнаружены путем загрузки клеток перед скрининге с кальций-чувствительным красителем, как Fluo-4 ацетоксиметил (AM) 11. Эфир группа AM позволяет флуорофором пересечь клеточную мембрану и отщепляется от цитоплазматических эстераз раз внутри клетки. Следовательно, отрицательные заряды флуоресцентным красителем которые без маски, предотвращая его диффузии из клетки и позволяет ему взаимодействовать с ионами кальция. Флуоресцентный сигнал ое Fluo-4 является незначительным в клетках в состоянии покоя, содержащих только концентрации кальция в наномолярном. Тем не менее, когда кальций высвобождается при активации рецептора, сигнал может увеличить в зависимости от концентрации в более чем в 100 раз, добровольно обеспечивает большое отношение сигнал-шум. Fluo-4 также обладает большой динамический диапазон для сообщения [кальций] вокруг K D (кальций) 345 нМ, что делает его пригодным для измерения физиологически соответствующие изменения кальция в широком диапазоне клеток. Возбуждение Fluo-4 происходит при 488 нм и флуоресцентное излучение измеряется при 525 нм 11. Флуориметров, как визуализация флуоресценции ридере (FLIPR) 23, Novostar, или FlexStation (станция устройство) 12 являются средние / системы высокой пропускной которые позволяют одновременно соединение сложение и обнаружение на флуо-4 сигнала при активации рецептора для каждой скважины в аналитический планшет. Анализ мобилизации кальция описано здесь опирается на станцииУстройство системы микропланшет с 96 лунками.
SoftMax Pro программное обеспечение (ПО) используется для управления устройством станции, а также для анализа данных. Программа немедленно отображает результаты в виде диаграмм в формате 96-а. Несколько скважин могут быть выбраны одновременно для сравнения результатов этих скважин на одном графике. Относительное флуоресцентный блок (РФС) значения скважин в каждом столбце, измеряются одновременно в течение двух минут, начиная перед добавлением соединений в лунки и продолжается после измерения флуоресцентного сигнала после активации рецептора. Как правило, тенденция кривой агониста выравнивается с базовой линией, пока активирующее соединение не будет добавлен к клеткам, что привело к быстрому увеличению флуоресцентного сигнала. Высота пика коррелирует с конечной концентрацией агониста в скважине. После пика, флуоресцентный сигнал медленно падает к базовому уровню. Измерения РФС окн быть переведены в кривые реакции на концентрацию для определения EC 50 значение (половина максимальная эффективная концентрация) лиганда. В целом, по крайней мере три независимых экранов, каждый из которых включает три реплик серии концентрации, должны быть выполнены, чтобы составить достоверную кривую концентрация-ответ.
Рекомендуется включать в себя несколько положительный и отрицательный контроль в экспериментальном дизайне. Прежде всего, контроль трансфекции, т.е. реализации рецептора с известным лигандом, должны быть проверены. Это позволяет проверить, является ли трансфекции агент был в рабочем состоянии. Включение контрольном эксперименте с агонистом для эндогенного рецептора клеточной линии и отрицательного контроля (например, промывочного буфера), также рекомендуется контролировать здоровье и жизнеспособность клеток и исключить возможность того, что промывочный буфер загрязненная фактором, который может вызвать авто-fluoreЗапах ответ. Часто используемые агонисты пептида, полученного из протеазы активированного рецептора-1 (PAR 1), который действует как PAR 1 селективного агониста, или карбахола, который активирует рецептор ацетилхолина. Клетки, трансфицированные пустой вектор экспрессии также должны быть проверены, чтобы исключить, что активные соединения взаимодействуют с эндогенными рецепторами клетки. Оптимизация нескольких параметров, описанных ниже в протоколе могут потребоваться для различных систем сигнализации. Схематический рисунок полного флуоресценции на основе кальция мобилизации анализа изображен на рисунке 1.
Измерения Рисунок 1. Общая схема флуоресценции основе кальция мобилизационной анализа. Автоматизированная обработка жидкости и одновременное флуоресценции выполняются со станциеймикропланшет устройства читатель, движимый с помощью программного обеспечения. Устройство станция содержит три ящика: один для планшета с клетками, соединение пластины и наконечник стойки. Встроенный в пипетки передает соединения из одной колонки составного пластины в соответствующей графе клеточной пластинки (шаг 1). Каждая лунка планшета с клетками содержит монослой HEK293T клеток, которые были котрансфицируют с GPCR интереса и беспорядочном Gα 16 субъединицы. Когда соединение активирует рецептор, Gα 16 переплете ВВП заменяется ГТФ. Gα 16 субъединицы впоследствии диссоциирует из комплекса Gβγ и активирует фосфолипазу Cβ (PLCβ), который в свою очередь гидролизует фосфатидилинозит бисфосфат (PIP 2), в результате диацилглицерина (DAG) и инозитол трифосфата (IP 3). ИП 3 активирует IP-каналы 3-зависимой кальция, имеющегося в мембране эндоплазматического ретикулума, вызывая высвобождение кальция Intо цитоплазма. Взаимодействие кальция с Fluo-4 (с которой клетки будут загружены до соединение дополнение) приводит к флуоресцентного сигнала (шаг 2). Программное обеспечение представляет результаты в виде относительной флуоресцентной блока (РФС) значений в зависимости от времени, и высоты пиков коррелирует с концентрацией лиганда в зависимости от концентрации. Эти данные затем могут быть преобразованы в кривой концентрация-ответ, чтобы определить значение пары лиганд-рецептор (шаг 3) EC 50.
Флуоресценция на основе кальций мобилизации анализ был успешно применен для подтверждения функциональную характеристику системы сигнализации пептидергические Drosophila sNPF, который был уже выполнены Мертенс и соавт. с биолюминесценции анализа и Фэн и др.. с электрофизиологического анализа 13,15. В ЕС 50 значения, полученные с флуоресцентного анализа в HEK293T клеток примерно в 10 раз меньше, чем полученные с биолюминесценции анализа, проведенного в клетках СНО (Дром-sNPF-1: фтор = 2,04 нМ, люми = 51 нМ; Дром-sNPF- 2: люм = 5,89 нМ, люми = 42 нМ; Дром-sNPF-3: фтор = 5,55 нМ, люми = 31 нМ; Дром-sNPF-4: фтор = 0,50 нМ, люми = 75 нМ). Эти вариации можно объяснить несколькими факторами, в том числе с тем, что один из используемых систем экспрессии может лучше подходить для функциональной экспрессии данного рецептора или сворачивание некоторых рецепторов может быть менее эффективным в Cтипы ertain клеток. EC 50 значения всех четырех дромо-sNPF пептидов находятся в диапазоне наномолярной при испытании на их рецепторов как с флуоресценции и биолюминесценции анализа, как правило, поддерживать физиологическое значение их взаимодействия пептид-рецептор в естественных условиях.
Следует отметить, что никакого контроля трансфекции с рецептором, для которого активации лиганд, как известно, не был включен в экране, представленной здесь, так как система сигнализации Drosophila sNPF, как правило, контроль трансфекции в экспериментальных установках. Положительный контроль с эндогенным лигандом HEK293T клеток (п. 1) и отрицательный контроль (промывочный буфер), были включены в экран. Результаты PAR 1 показали, что клетки были в хорошем состоянии. Отрицательный контроль (промывочный буфер) не вызывают флуоресцентный сигнал, который указывает, что среда, в которой пептиды растворяют был свободен от любых загрязнений, которые могут INFluence результаты.
Ранее характеризуется сигнальная система дрозофила sNPF был использован здесь, чтобы объяснить флуоресценции основе кальция мобилизационной анализа. С этой целью концентрации ряд активирующих лигандов были испытаны немедленно. Однако, когда сиротский рецептор доводится до повышенной экспрессией в скрининге, чтобы проверить библиотеку, содержащую сотни соединений, рекомендуется, чтобы первый экран с относительно высокими конечных концентраций лигандов (например., 10 или 1 мкМ). После обнаружения активирующего соединения, серия разбавление этого соединения могут быть подвергнуты скринингу, чтобы составить кривую концентрация-ответ и определить значение EC 50.
После активации лиганд рецептора определяется, внутриклеточный сигнальный путь может быть дополнительно исследованы путем адаптации протокола. Анализ может быть выполнен, как описано выше, но без со-трансфекции G ^5; 16 субъединицы. Когда реакция кальция измеряется, это означает, что пары рецептор, с эндогенной Gα д субъединицы системе сотовой выражение. Когда не наблюдается флуоресцентный сигнал, протоколы для измерения изменений в концентрациях других вторичных мессенджеров (например., ЦАМФ) могут быть применены.
Соотношение структура-активность (SAR) исследования также может быть осуществлена, чтобы определить основную последовательность пептида, необходимое для активации рецептора. Во-первых, усеченные последовательности оценивают, чтобы определить минимальную последовательность аминокислот пептида, который все еще способен активировать рецептор. Далее, пептиды могут быть проверены в котором систематически каждый аминокислота заменена на остатком аланина. Тестирование синтетического серию аланин-заместительной на рецептор позволяет определить важность каждого из аминокислот для активации рецептора 24,25.
Несмотря на частое использование и проверенных эффективность, то следует подчеркнуть, что анализ, описанный здесь может потребоваться некоторые приспособления, чтобы получить оптимальные результаты для специфических рецепторов, представляющих интерес. Gα 16 субъединицы имеет то преимущество, что он связывается с большинством GPCRs, но может также иметь доминантно-негативный эффект на рецепторы, которые эндогенно пара через Gα д 22. В этом случае может быть полезным, чтобы проверить различные комбинации G белков при оптимизации нового анализа кальция и сравнить результаты для Gα Q-связанных рецепторов в отсутствие или в присутствии Gα 16. Альтернативные анализы, которые не зависят от взаимодействующего белка G, чтобы обнаружить активацию рецептора также может быть выполнена, например, транслокации GFP-меченых аррестина, или выявления изменений мембранного потенциала (например., На FLIPR мембранного потенциала набора для анализа). Кроме того, Fluo-4 утра здесь используется, широкий спектр других кальция чувствительных флуорофорами, каждый со своим собственным спектрального и химикоаль свойства, доступно. Наиболее подходящий флуорофор может быть выбран на основе GPCR, типа клеток и доступной планшет-ридере, но экспериментальное подтверждение необходимо. Количества трансфицированных ДНК, а также необходимость соотношении реагент ДНК / трансфекции, которые будут определены для каждого рецептор-трансфекции комбинации реагент-клеточной линии. Наконец, следует иметь в виду, что клетки в непрерывной культуре только позволяют 20-25 используемые проходы для выполнения скрининга.
The authors have nothing to disclose.
Авторы признают, Foundation Фландрия исследований (FWO-Vlaanderen, Бельгия, G.0601.11) и KU Leuven Research Foundation GOA/11/002. И.Б., TJ и LT выгоды от общения с FWO-Vlaanderen.
HEK293T cells | |||
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
Trypsin-EDTA solution (0.25%) | Sigma-Aldrich | T4049 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | MP Biomedicals | 195173 | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
Penicillin-Streptomycin (P-S) | Sigma-Aldrich | P4333 | |
jetPRIME | Polyplus transfection | 114-01 | FuGENE HD Transfection Reagent (Promega); Lipofectamine LTX & Plus Reagent (Life technologies) |
Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F0392 | |
Fibronectin from human plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
Reagent A100, Lysis buffer | Chemometec | 910-0003 | |
Reagent B, Stabilizing buffer | Chemometec | 910-0002 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3881 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503 | |
HBSS buffer: Hank's Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | H8264 | |
Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | |
NaOH (1 M) | Vel | 2781 | |
Pluronic acid | Invitrogen | P-3000MP | |
Dimethyl-sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
Fluo-4 AM | Invitrogen | F14201 | Fluo-3, Rhod-2, Fluo-5, Calcium Green-1,.. (Invitorgen) |
TPP tissue culture flasks (T-75 and T-150) | Sigma-Aldrich | Z707503 and Z707554 | |
FlexStation device | Molecular Devices | NOVOstar (BMG Labtechnologies); FLIPR (Fluorometric Imaging Plate Reader) (Molecular Devices) | |
Black-walled polystyrene plates (96 wells) with clear bottom | Greiner Bio-One | 655090 | Corning 96 well flat clear bottom black polystyrene poly-D-lysine coated microplates |
NucleoCassette | Chemometec | 941-0001 | |
NucleoCounter NC-100 | Chemometec | ||
Microcentrifuge tubes, siliconized | BioCision | BCS-2470 | |
Polystyrene V-shaped 96-well plates | Greiner Bio-One | 651101 | |
96-Well, FlexStation Pipet Tips | Molecular Devices | 9000-0912 | |
Soft Max Pro software | Molecular Devices |