De hier beschreven op fluorescentie gebaseerde calcium-mobilisatie assay is een medium-doorvoer screening omgekeerde farmacologie identificatie van functioneel activerend ligand (en) orphan G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCR).
Al meer dan 20 jaar, heeft omgekeerde farmacologie bij uitstek de strategie om de activerende liganden van orphan G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCR's) ontdekken geweest. Het begin van een omgekeerde farmacologie assay is de klonering en daaropvolgende transfectie van een GPCR plaats in een cellulair expressiesysteem. De heterologe expressie gebrachte receptor wordt daarna uitgedaagd met een verbinding bibliotheek van kandidaat liganden aan de receptor-activerende ligand (en) te identificeren. Receptor activering kan worden beoordeeld door het meten van veranderingen in de concentratie van second messenger reporter moleculen, zoals calcium of cAMP. De fluorescentie gebaseerde calciummobilisatie test hier beschreven is een vaak gebruikte medium-throughput omgekeerde farmacologie assay. De wees GPCR wordt tijdelijk in humane embryonale nier 293T (HEK293T) cellen en een promiscue Ga-16 construct gecotransfecteerd. Na ligand binding, de activering van de Ga-16 subeenheid induceert het vrijkomen van calcium from het endoplasmatisch reticulum. Vóór ligand screening, worden de receptor tot expressie brengende cellen geladen met een fluorescente calcium indicator Fluo-4 acetoxymethyl. Het fluorescentiesignaal van Fluo-4 verwaarloosbaar in cellen onder rusttoestand, maar kan meer dan 100-voudige op de interactie met calciumionen die vrijkomen na receptoractivering worden geamplificeerd. De beschreven techniek vereist geen tijdrovende instelling van stabiel getransfecteerde cellijnen waarin het getransfecteerde genetisch materiaal wordt geïntegreerd in het genoom van de gastheercel vereisen. In plaats daarvan, een transiënte transfectie, genereren tijdelijke expressie van het doelwitgen, is voldoende om de screening assay. De opstelling laat het midden-throughput screening van honderden verbindingen. Co-transfectie van de promiscue Ga-16 voor koppeling meeste GPCRs, kan de intracellulaire signaalroute te heroriënteren naar het vrijkomen van calcium, ongeacht de natieve signaalweg in endogene settgen. De HEK293T cellen zijn gemakkelijk te hanteren en hebben hun effectiviteit door de jaren heen in receptor ontwezing testen bewezen. Echter, kan optimalisatie van de assay voor specifieke receptoren noodzakelijk blijven.
G-proteïne gekoppelde receptoren (GPCR's) zijn een van de grootste en meest diverse families van alle eiwitten van het celoppervlak. Hun aanwezigheid in vertebraten, invertebraten, planten, gist, schimmels en slijm, en in Protozoa en de vroegste diploblastic Metazoa aangeeft dat GPCRs tot de oudste moleculen gekoppeld signaaltransductie 1. Hun natuurlijke activerende liganden behelzen een scala van externe stimuli zoals peptiden, biogene aminen, geurstoffen, glycoproteïnen, en fotonen 2. Als zodanig zijn deze receptor-ligand signalering ook die een grote verscheidenheid aan fysiologische processen. Het brede spectrum functionele maakt ze bij uitstek geschikt voor de ontwikkeling van therapeutische geneesmiddelen die een breed spectrum van menselijke ziekten te dekken. Ongeveer 50-60% van de huidige drug targets worden vertegenwoordigd door GPCR 3,4. Naast hun grote belang in de farmaceutische industrie, GPCRs zijn ook de kijker voor het ontwikkelen van eennieuwe generatie van soortspecifieke insecticiden 5,6 en pesticiden in het algemeen. Omdat de natuurlijke liganden van vele GPCR's zijn nog niet geïdentificeerd, worden ze ingedeeld als orphan GPCR's. De ontwezing van deze receptoren zal het begrip van hun fysiologische rol in organismen te verbeteren en kunnen mogelijke targets te ontdekken voor nieuwe drug toepassingen 7.
Sinds de genomische tijdperk, is het omgekeerde farmacologie strategie op grote schaal toegepast voor de ontwezing van GPCR's 8. De benadering impliceert dat een orphan receptor wordt gebruikt als een "haak" m "vissen uit 'de activerende ligand van een biologisch extract of uit een bibliotheek van synthetische stoffen. De GPCR plaats wordt daarom gekloneerd en vervolgens getransfecteerd in een cellulair expressiesysteem. In de meest gebruikte werkwijzen wordt receptoractivering bepaald door veranderingen in de concentratie van tweede boodschappermoleculen 9 </sup>. De belangrijkste receptor screeningstesten afhankelijk calcium-gevoelige bioluminescente eiwitten (bijv. aequorin) 10 of fluorescente calcium indicatoren (bijv. Fluo-4) 11. De fluorescentie gebaseerde testen, waarbij-receptor tot expressie cellen met een fluorescente calcium indicator voor ligand screening, hebben het voordeel dat ze laten high-throughput screening vanwege hun gebruiksgemak, korte leestijd en de flexibiliteit van screening meerdere weesreceptoren op een enkele plaat 12.
Hier wordt de fluorescentie gebaseerde calcium-mobilisatie assay grondig beschreven en geïllustreerd door de ontwezing werkwijze volgens de Drosophila melanogaster korte neuropeptide F (SNPF) receptor. Dit neuropeptiderge signaleringssysteem werd oorspronkelijk gekenmerkt door Mertens et al.. 2002 13 met een calcium-bioluminescentie assay uitgevoerd in Chinese hamster ovarium (CHO)-cellen14 en door Feng et al.. In 2003 met een elektrofysiologische test met behulp van Xenopus oöcyten 15. De aanwezigheid van het SNPF signaleringssysteem lijkt beperkt tot de phylum van Arthropoda, waar het is betrokken bij een groot aantal processen, zoals de regeling van het voeden, groei, stressreacties, motoriek en circadiane ritmes 16.
Onderzoek naar neuropeptiderge signaleringssystemen bij insecten kan niet alleen leiden tot nieuwe doelen voor de ontwikkeling van insecticiden, maar de kennis van hun werking kan ook worden geëxtrapoleerd naar andere organismen zoals velen signalering systemen zijn over het algemeen goed gebleven doorheen de evolutie 17. In het laatste decennium, heeft grote vooruitgang geboekt in het ontwezing proces van insecten neuropeptide GPCR's. Ondanks deze inspanningen zijn er slechts een klein aantal receptoren zijn afgestemd op hun verwante ligand, en tal van sequentie-informatie voornieuwe orphan GPCR's is beschikbaar vanwege de booming van genomics 18 geworden. De beschikbaarheid drager / high-throughput screening methoden, zoals fluorescentie gebaseerde calcium-mobilisatie assay die heeft bewezen een veel toegepaste techniek 9,18 zijn, dus onschatbaar.
De fluorescentie gebaseerde calcium mobilisatie assay zoals beschreven wordt uitgevoerd in humane embryonale nier 293T (HEK293T) cellijn en gebruikt een fluorescente probe veranderingen in intracellulaire calciumconcentraties te bepalen na receptoractivering. Om een hoge expressie niveaus en translatie van het receptor waarborgen, wordt een Kozak consensussequentie 19 toegevoegd aan het einde van de receptor coderende sequentie, dat vervolgens wordt gekloneerd in een expressievector (bv. pcDNA vector serie voor zoogdiercellijnen) het 5 '. Omdat het moeilijk is om het endogene G-eiwit-koppeling van een wees GPCR basis van sequentie-informatie voorspellenalleen, de tweede boodschapper moleculen (bijvoorbeeld calcium of cAMP) die worden gemoduleerd na activering van de receptor vaak onbekend blijven voorafgaand aan ligand identificatie. Om dit probleem te omzeilen, promiscue G-eiwitten van de G q familie (bijvoorbeeld van muis Ga-15 of menselijke Ga-16 [hier gebruikt]) of chimere G-eiwitten (bijvoorbeeld, Ga-qi5) die interageren met de meeste GPCR's en veroorzaken het vrijkomen van calcium kan mede worden uitgedrukt 20,21,22. Na binding van de ligand aan de receptor, de GPCR ondergaat een conformationele verandering die leidt tot de activering van specifieke intracellulaire wegen. De guanosine difosfaat (GDP) molecuul, onder rusttoestand de Ga-16 subeenheid gebonden, wordt vervangen door een guanosine trifosfaat (GTP) molecuul. Dit veroorzaakt de dissociatie van de heterotrimere G proteïne in een Ga-16 en Gβγ subeenheid. De Ga-16 subeenheid activeren fosfolipase C &# 946; (PLCβ), die op zijn beurt hydrolyseert het membraangebonden fosfatidylinositol bisfosfaat (PIP2) waardoor diacylglycerol (DAG) en inositol trifosfaat (IP3). IP3 wordt verspreid over het cytoplasma en activeert IP3-afhankelijke calciumkanalen in de membraan van het endoplasmatisch reticulum, die de afgifte van calcium in het cytoplasma.
De calciumafgifte bij receptoractivering plaatsvindt binnen seconden en kan worden gedetecteerd door het laden van cellen voor de screening test met een calcium-gevoelige kleurstof, Fluo-4 zoals acetoxymethyl (AM) 11. De AM estergroep kan de fluorofoor aan de celmembraan passeren en afgesplitst door cytoplasmatische esterasen eenmaal binnen de cel. Bijgevolg, de negatieve ladingen van de fluorescente kleurstof worden ontmaskerd, waardoor deze diffundeert uit de cel en te laten interageren met calciumionen. De fluorescerende signaal of Fluo-4 is te verwaarlozen in cellen onder rusttoestand alleen met calcium concentraties in het nanomolaire gebied. Wanneer calcium wordt vrijgegeven na receptoractivering kan het signaal concentratie-afhankelijke verhogen tot meer dan 100-voudige, hierbij zorgen voor een grote signaal-ruisverhouding. Fluo-4 vertoont ook een groot dynamisch bereik voor het melden van [calcium] rond een K d (calcium) van 345 nM, waardoor het geschikt is om fysiologisch relevante calcium veranderingen in een breed scala van cellen te meten. De excitatie van Fluo-4 treedt op bij 488 nm en de fluorescentie emissie wordt gemeten bij 525 nm 11. Fluorimeters zoals de fluorescentie beeldvorming plaatlezer (FLIPR) 23, de Novostar, of het FlexStation (station apparaat) 12 zijn middelgrote / high-throughput systemen die gelijktijdig verbinding toevoeging en de detectie van de Fluo-4 signaal op receptor activering mogelijk maken voor elke goed een testplaat. De mobilisatie van calcium test hier beschreven is gebaseerd op het stationapparaat 96-well microplaat systeem.
De SoftMax Pro-software (software) gebruikt om het apparaat te bedienen station en voor gegevensanalyse. Het programma toont onmiddellijk de resultaten in grafieken in 96-well formaat. Meerdere putjes kunnen gelijktijdig worden geselecteerd om de resultaten van deze putten vergelijken op dezelfde grafiek. De relatieve fluorescentie-eenheid (RFU) waarden van putjes in elke kolom worden gelijktijdig gedurende twee minuten, beginnen voor de toevoeging van verbindingen aan de putjes en permanente na meting van het fluorescentiesignaal volgende receptoractivering. Typisch, de ontwikkeling van een agonist curve uitgelijnd met de basislijn tot een activerende verbinding wordt toegevoegd aan de cellen, resulterend in een snelle toename van het fluorescentiesignaal. De piekhoogte is gecorreleerd met de uiteindelijke agonist concentratie in de put. Na de piek, het fluorescerende signaal langzaam daalt naar het basisniveau. De RFU metingen can worden omgezet in concentratie-respons curves voor de EC 50-waarde (de helft van de maximale effectieve concentratie) van een ligand te bepalen. In het algemeen, ten minste drie onafhankelijke schermen, elk met drie replica van een concentratie reeks moet worden uitgevoerd om een betrouwbare concentratie-responscurve samenstellen.
Het wordt aanbevolen om een aantal positieve en negatieve controles in proefopzet. Allereerst een transfectie controle, namelijk de toepassing van een receptor met een bekende ligand, worden getest. Dit maakt het mogelijk na te gaan of de transfectiemiddel was operationeel. Opneming van een controle-experiment met een agonist van een endogene receptor van de cellijn en een negatieve controle (bijvoorbeeld wasbuffer) worden ook aanbevolen bewaken de gezondheid en levensvatbaarheid van de cellen en de mogelijkheid dat de wasbuffer werd verontreinigd sluiten een factor die een auto-fluore kon ontlokkengeur reactie. Veelgebruikte agonisten een peptide afgeleid van het protease-geactiveerde receptor-1 (PAR 1), die als PAR 1 selectieve agonist of carbachol, die acetylcholine receptor activeert. Cellen getransfecteerd met een lege expressievector moet worden getest te sluiten dat actieve verbindingen interageren met endogene receptoren van de cel. Optimalisatie van verscheidene parameters in de hieronder beschreven protocol kan nodig zijn voor verschillende signaleringssystemen. Een schematische figuur van een totale fluorescentie gebaseerde calcium mobilisatie assay is weergegeven in figuur 1.
Figuur 1. Algemeen schema van de fluorescentie gebaseerde calciummobilisatie assay. Geautomatiseerde liquid handling en gelijktijdige fluorescentie metingen worden uitgevoerd met het stationapparaat microplaat lezer, aangedreven door de software. Het station apparaat bevat drie laden: een voor de cel plaat, samengestelde plaat en nog veel rek. De ingebouwde pipet overdrachten verbindingen uit een kolom van de samengestelde plaat in de overeenkomstige kolom van de celplaat (stap 1). Elk putje van de cel plaat bevat een monolaag van HEK293T cellen die zijn co-getransfecteerd met de GPCR van belang en de promiscue Ga-16 subeenheid. Wanneer een verbinding activeert de receptor, wordt de Ga-16 gebonden BNP vervangen door GTP. De Ga-16 subeenheid vervolgens dissocieert het complex en activeert Gβγ fosfolipase Cp (PLCβ), die op zijn beurt hydrolyseert fosfatidylinositol bisfosfaat (PIP2) waardoor diacylglycerol (DAG) en inositol trifosfaat (IP3). IP3 activeert IP3-afhankelijke calciumkanalen in de membraan van het endoplasmatisch reticulum, het induceren van de afgifte van calcium into het cytoplasma. De interactie van calcium met Fluo-4 (waarbij de cellen voorafgaand aan de toevoeging verbinding geladen) resulteert in een fluorescent signaal (stap 2). De software stelt de resultaten relatieve fluorescerende eenheid (RFU) waarden als functie van de tijd en piekhoogtes correleren met de ligand concentratie in een concentratie-afhankelijke wijze. Deze gegevens kunnen vervolgens worden omgezet in een concentratie-responscurve op de EC 50-waarde van een ligand-receptor paren (stap 3) bepalen.
De fluorescentie gebaseerde calcium-mobilisatie assay werd met succes toegepast op de functionele karakterisatie van Drosophila SNPF peptiderge signalen, dat reeds werd uitgevoerd door Mertens et al. bevestigen. met bioluminescentie assay en Feng et al.. met een elektrofysiologische test 13,15. De EC 50-waarden verkregen met de fluorescentie assay in HEK293T cellen zijn ongeveer 10 maal lager dan deze die verkregen met de bioluminescentie test uitgevoerd in CHO-cellen (Drome-SNPF-1: fluo = 2,04 nM, lumi = 51 nM, Drome-SNPF- 2: fluo = 5.89 nM, lumi = 42 nM, Drome-SNPF-3: fluo = 5.55 nM, lumi = 31 nM, Drome-SNPF-4: fluo = 0,50 nM, lumi = 75 nM). Deze verschillen kunnen worden verklaard door verschillende factoren, waaronder het feit dat een van de gebruikte expressiesystemen beter geschikt voor functionele expressie van een bepaalde receptor kan zijn, of het vouwen van sommige receptoren kunnen minder efficiënt in cepaalde celtypen. De EC50 waarden van alle vier Drome-SNPF peptiden in het nanomolaire bereik wanneer getest op hun receptor met zowel de fluorescentie en bioluminescentie test algemeen ondersteunen de fysiologische relevantie van de peptide-receptor interactie in vivo.
Er worden geen transfectiecontrole met een receptor waarvoor de activerende ligand bekend is in het hier gepresenteerde scherm, omdat de Drosophila SNPF signaleringssysteem normale transfectie controle experimentele opstellingen. De positieve controle met een endogene ligand van de HEK293T cellen (PAR 1) en de negatieve controle (wasbuffer) werden in het scherm. De resultaten van PAR 1 bleek dat de cellen in een goede conditie. De negatieve controle (wasbuffer) heeft een fluorescent signaal opwekken, wat aangeeft dat het medium waarin de peptiden opgelost was vrij van verontreinigingen die influence de resultaten.
De eerder gekenmerkt Drosophila SNPF signaleringssysteem werd hier gebruikt om de fluorescentie gebaseerde calciummobilisatie assay verklaren. Hiertoe werden concentratie reeks van de activerende liganden direct getest. Wanneer evenwel een orphan receptor tot overexpressie in een screeningstest een bibliotheek met honderden testverbindingen wordt gebracht, wordt aanbevolen eerste scherm met relatief hoge eindconcentraties van de liganden (bijv.., 10 of 1 uM). Nadat de aanwezigheid van een activerende verbinding, een verdunningsreeks van die verbinding worden gescreend teneinde een concentratie-respons curve samenstellen en de EC 50 waarde te bepalen.
Wanneer de activerende ligand van een receptor wordt bepaald, kan de intracellulaire signaalroute verder onderzocht door aanpassing van het protocol. De test kan worden uitgevoerd zoals hierboven beschreven, maar zonder co-transfecteren van de G ^5, 16 subeenheid. Wanneer een calciumrespons gemeten, betekent dat de receptor paren met een endogeen q Ga-subeenheid van het cellulaire expressiesysteem. Als er geen fluorescerend signaal wordt waargenomen, kan protocollen op veranderingen in de concentraties van andere secundaire boodschappers (bijv.., CAMP) meten worden toegepast.
Structuur-activiteit (SAR) studies kan ook worden uitgevoerd om de peptide kern juiste volgorde voor een receptor activering definiëren. Eerst worden ingekorte sequenties beoordeeld om de minimale aminozuursequentie van het peptide dat nog kan de receptor activeren definiëren. Vervolgens kunnen peptiden worden getest die systematisch heeft elk aminozuur gesubstitueerd voor een alanineresidu. Testen synthetische alanine-substitutie serie over de receptor kan het belang van elk van de aminozuren voor receptoractivering 24,25 bepalen.
Ondanks het veelvuldige gebruik en bewezen effiCacy, moet worden benadrukt dat de hier beschreven test kan nodig enkele aanpassingen om optimale resultaten voor specifieke receptoren van belang winnen. De Ga-16 subeenheid heeft het voordeel dat het bindt aan de meeste GPCRs, maar kan ook een dominant-negatief effect op receptoren endogeen partner via Ga-q 22. In dit geval kan het nuttig zijn verschillende combinaties van G-eiwitten getest tijdens de optimalisatie van een nieuwe calciumkanalen test en de resultaten voor Ga-q-gekoppelde receptoren te vergelijken in de afwezigheid of aanwezigheid van Ga-16 is. Alternatieve testen die onafhankelijk zijn van de interactie G eiwit receptoractivering detecteren zijn kunnen ook worden uitgevoerd, zoals de translocatie van GFP-gemerkte arrestin of de detectie van veranderingen in membraanpotentiaal (bijvoorbeeld. Door de FLIPR Membraanpotentiaal testkit). Naast gebruikte de Fluo-04:00 hier, een breed scala aan andere calcium-gevoelige fluoroforen, elk met een eigen spectrale en chemieal eigenschappen, is beschikbaar. De meest geschikte fluorofoor kan worden gekozen op basis GPCR, celtype en de beschikbare plaatlezer, maar experimentele verificatie noodzakelijk. De bedragen getransfecteerd DNA en het DNA / transfectiereagens verhouding moeten worden bepaald voor elke receptor-transfectiereagens-cellijn combinatie. Ten slotte moet in gedachten worden gehouden dat cellen in continue kweek staan slechts 20-25 bruikbare passages aan de screeningstesten voeren.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs erkennen het Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (FWO-Vlaanderen, België, G.0601.11) en de KU Leuven Research Foundation GOA/11/002. IB, TJ en LT profiteren van een beurs van het FWO-Vlaanderen.
HEK293T cells | |||
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
Trypsin-EDTA solution (0.25%) | Sigma-Aldrich | T4049 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | MP Biomedicals | 195173 | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
Penicillin-Streptomycin (P-S) | Sigma-Aldrich | P4333 | |
jetPRIME | Polyplus transfection | 114-01 | FuGENE HD Transfection Reagent (Promega); Lipofectamine LTX & Plus Reagent (Life technologies) |
Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F0392 | |
Fibronectin from human plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
Reagent A100, Lysis buffer | Chemometec | 910-0003 | |
Reagent B, Stabilizing buffer | Chemometec | 910-0002 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3881 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503 | |
HBSS buffer: Hank's Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | H8264 | |
Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | |
NaOH (1 M) | Vel | 2781 | |
Pluronic acid | Invitrogen | P-3000MP | |
Dimethyl-sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
Fluo-4 AM | Invitrogen | F14201 | Fluo-3, Rhod-2, Fluo-5, Calcium Green-1,.. (Invitorgen) |
TPP tissue culture flasks (T-75 and T-150) | Sigma-Aldrich | Z707503 and Z707554 | |
FlexStation device | Molecular Devices | NOVOstar (BMG Labtechnologies); FLIPR (Fluorometric Imaging Plate Reader) (Molecular Devices) | |
Black-walled polystyrene plates (96 wells) with clear bottom | Greiner Bio-One | 655090 | Corning 96 well flat clear bottom black polystyrene poly-D-lysine coated microplates |
NucleoCassette | Chemometec | 941-0001 | |
NucleoCounter NC-100 | Chemometec | ||
Microcentrifuge tubes, siliconized | BioCision | BCS-2470 | |
Polystyrene V-shaped 96-well plates | Greiner Bio-One | 651101 | |
96-Well, FlexStation Pipet Tips | Molecular Devices | 9000-0912 | |
Soft Max Pro software | Molecular Devices |