Bu opioid kaynaklı hiperaljezi ve farelerde tolerans gelişimini incelemek için bir protokol açıklar. Naif ve morfin ile tedavi edilen hayvanların, termal ve mekanik nosiseptif yanıtların ölçümü dayanarak, ağrı duyarlılığı (hiperaljezi) 'de artışı ölçmek ve kronik opiat uygulama ile bağlantılı analjezi (tolerans) azalma sağlar.
Opioid kaynaklı hiperaljezi ve tolerans ciddi hayvanlarda ve insanlarda ağrı kesiciler gibi uyuşturucuların klinik etkinliğini etkileyebilir. Her iki fenomenlerin altında yatan moleküler mekanizmalar tam olarak anlaşılmış değildir ve bunların aydınlatılması hayvan modellerinin çalışma ve uygun deneysel protokollerin tasarımı yararlanmalıdır.
Burada, indükleyici kayıt ve vahşi tip farelerde kuyruk-daldırma ve kuyruk basınç testleri kullanılarak, analjezik tolerans gösteren hem de morfin kaynaklı hiperaljezi miktarının belirlenmesi için bir metodolojik yaklaşımı tarif eder. Videonun gösterildiği gibi, protokol beş ardışık aşamaya ayrılır. Kullanım ve alışkanlık fazlar hayvanların bazal nosiseptif tepki güvenli bir kararlılık sağlar. Her ikisi de, termal ve mekanik duyarlılığında bir artışa ile gösterildiği gibi kronik morfin uygulama, önemli bir hiperaljeziyi indükler oysa sonra analjezi zamanlı kursların karşılaştırma akut ya da temsilcisieated morfin tedavisi açıkça analjezik yanıt genliğinde bir azalma ile kendini gösteren tolerans gelişimini gösterir. Bu protokol, aynı şekilde nosisepsiyon ve morfin analjezi modülasyonunda tek tek genlerin rolünü değerlendirmek amacıyla genetik olarak modifiye edilmiş fareler için adapte edilebilir. Ayrıca opiat analjezik etkinliğini artırmak için potansiyel terapötik ajanların etkinliğini araştırmak için bir model sistemi sağlar.
Opioid kaynaklı hiperaljezi (OIH) ve analjezik tolerans hayvanlarda ve insanlarda 1-3 opiat klinik etkinliklerini sınırlayabilmektedir. Pro-enflamatuar 4,5 'ya pro-nosiseptif (anti-opioid) 6,7 sistemlerinin katılımı halen hipotezler incelenmiştir. OIH ve tolerans altında yatan mekanizmaların aydınlatılması uygun hayvan modelleri, deney protokollerini ve moleküler araçları kullanarak, in vivo ve in vitro yaklaşımlar bir arada gerektirmektedir.
Davranış farmakoloji laboratuvar hayvanlarında analjezik ve hiperaljezik durumlarını izlemek ve ölçmek için egemen paradigma (sıçan, fare) 'dir. Hayvanın uygun bir gövde parçası (arka pençe, yükleme) bir zararlı uyarıcı (termal, mekanik ya da kimyasal) uygulaması kolay atılır bir nocifensive çekilmesine yol açar.
Biz OIH, uyaran kayıt ve ölçülmesi için burada metodolojik bir yaklaşım önermiştir vekuyruk-daldırma ve kuyruk basınç testleri kullanarak, vahşi tip farelerde tolerans. Prosedür farelerde termal ve mekanik nosiseptif tepki değerlerinin bir kolay, hassas ve tekrarlanabilir belirlenmesini sağlar. Video protokolü de gösterildiği gibi, C57BL / 6 fareleri, kronik morfin uygulamasından alttaki önemli hiperaljezi deneyim ve birkaç gün boyunca korur. Her ikisi de, termal ve mekanik nosiseptif değerler önemli ölçüde naif hayvanlarda bazal ölçümleri ile karşılaştırıldığında azalır. Ayrıca, bizim deneysel set-up OIH, morfin (tolerans) için analjezik yanıt düşüş gelişimine ek olarak, izlemenizi sağlar. Sunulan veriler bu literatürde 1,10-12 tartışmalı olmasına rağmen hiperaljezi ve hoşgörü, ortak hücresel ve moleküler mekanizmaları 8,9 içerebilir olduğu görüşünü desteklemektedir. Son olarak, bu protokol benzer modülatöründen tek tek genlerin rolünü değerlendirmek için genetik olarak modifiye edilmiş fareler şekilde uyarlanabilirağrı tion. Aynı zamanda, bir opiat analjezik etkileri iyileştirmek için potansiyel terapötik maddelerin etkinliğini değerlendirmek için bir model sistem sağlar.
Kritik Adımlar
Nosisepsiyon ölçümleri için hayvan modeli seçimi
Fareler suşları arasında nosiseptif ve analjezik duyarlılık Değişkenlik etiolojide farklı çeşitli ağrı modelleri kullanarak (yorum 14-16) değerlendirmeleri incelenmiştir (nosiseptif, enflamatuvar, nöropatik), modalite (termal, kimyasal, mekanik), süresi (akut, tonik, kronik) ve tatbikat alanı (deri içinden, deri altından, iç organ). Diğer suşlar ile karşılaştırıldığında bir yüksek bazal nosiseptif hassasiyet 17,18 ve 14,19 afyon bir orta analjezik tepki gösterir ve bu durum, C57BL/6J fareler (Jackson Laboratory için "J"), ağrı çalışmaları için uygun bir hayvan modeli oldu. Kronik morfin tedavisi ardından, aynı zamanda önemli bir analjezik toleransı 20,21, hiperaljeziyi 21,22 ve 20,23 bağımlılık gelişir.
nt "> Burada, deney C57BL/6N Tac fareler üzerinde gerçekleştirilmiştir B6 soy ayrı bir dalı aittir (" Taconics grubu için Tac '"Ulusal Sağlık Enstitüsü için" N.) C57BL / 6 fareleri, uzun olmasına rağmen değiştirilebilir, son çalışmalar C57BL/6J ve C57BL/6N 24 suşları arasında önemli davranış farklılıkları işaret olarak kabul. özellikle, termal ağrı akut (Tac bir de dahil olmak üzere) üç C57BL/6N substrains alt duyarlılığı olarak kabul edilebilir Bu fenotip için test avantaj.Erkek fareler çocuk erkeklerde 25 üzerinde gerçekleştirilir, hayvan modeli olarak fareler kullanılarak, ağrı çalışmaların büyük çoğunluğu olarak seçildi. Görüş analjezi veya hiperaljezi noktaları incelendiğinde bizim ellerimizde, onlar güçlü ve tekrarlanabilir verileri sağlamıştır. Bazen, biz C57BL/6N kadın TİT ve TPT testlerinde hem de daha değişken yanıtları sağlamak için bir eğilim fark ettim. Bu gözlem rağmenkadınların hormonal durumuna bağlı doğal varyasyonları yansıtmak, ağrı ve analjezi cinsiyet farklılıkların altında yatan genel mekanizmaları hala tartışma konusu olmaya devam etmektedir. Bu sıcak tartışmaların bazı yönleri kısaca bölümünün yanındaki 'tekniği Sınırlamalar' sunulacak.
Hayvan alışkanlık
Fareler ilk bir hafta boyunca hayvan tesis alışması için izin verildi. Başka bir davranış çalışmaya benzer şekilde, 3 günlük bir test-iklime alıştırma periyodundan (Şekil 1, aşama A) uyularak gerçekleştirildi. Nosiseptif testleri strese duyarlı olarak, ilk önlemler özellikle olmayan Alışmış farelerde 26,27 olarak, sonraki olanlardan daha uzun gecikmeleri verebilir. Alışkanlık adımı da aynı gün içinde ve gün arasında daha dengeli nosiseptif tepki değerlerinin obtention 2 ve 4, Şekil sağlar. Nosiseptif ve analjezik sirkadiyen etkilerini azaltmak içinduyarlılık 28,29, bütün denemeleri 10:00-04:00 yapılmıştır.
Nosiseptif testlerin seçimi
Nosiseptif testler termal, mekanik, kimyasal veya elektriksel uyaranlar (yorum 26,27,30. Farklı nosiseptif yöntemleri farklı Nosiseptörlerin ve liflerin 18,31,32 yoluyla işlenen edilebilir Onların seçim kritik kullanabilirsiniz.
Biz termal örnek olarak Randall ve Selitto 35 uyarlanan kuyruk daldırma testi (TİT) 33, D'amour ve Smith 34 tarafından geliştirilen klasik kuyruk darbesi testinin değiştirilmiş versiyonu, ve kuyruk basınç testi (TPT), seçilmiş ve farelerde morfinin neden analjezi, hiperaljeziyi ve hoşgörü çalışma mekanik yöntemler. Her iki test yaygın sıçanlarda kullanılmaktadır. Bir zaman kesme sistematik doku hasarı riskini önlemek veya sınırlamak için tanımlanmıştır.
Morfin-induced analjezi, hiperaljezi ve tolerans
Bu güçlü bir analjezik ve OIH indükleyici olarak Morfin, prototip mu-opioid agonist, insanlarda ve hem de farelerde 1,2,36, burada seçildi. Morfin analjezik etki farenin suşları, tatbikat yolları ve nosiseptif yöntemleri ile değişir bilinmektedir. C57BL / 6 farelerinde, güvenilir bir analjezi, genellikle 1-20 mg / kg doz aralığında 14,21 morfin deri altı enjeksiyonu ile elde edilir. Buna göre, termal nosisepsiyon 19,21 değerlendirilmiştir olan ED 50 değeri (7-20 mg / kg) yakın 5 mg / kg, en morfin tek bir uygulama (sc) aşağıdaki akut analjezi çalışma seçtik.
Tekrarlanan morfin uygulama sık ve hiperaljezi (ağrılı stimülasyonu için bir şiddetlenir hassasiyet (doz-yanıt eğrisinin bir sağa kayma ya da bir analjezik karşılık, genlik ve süresi azalıştan ya da kanıtladığı) analjezik toleransı ile eşliki) bazal nosiseptif değer bir azalma ile kanıtlandığı. Her ikisi de olumsuz etkiler tedavi süresi ve nosiseptif yöntemleri 21 opiat seçilir bileşik ve dozaj, doğasına, kemirgen suşları bağlıdır. Örneğin, tolerans ve hiperaljeziyi çalışma deneysel paradigmalar yüksek ve sabit (günde 20-40 mg / kg) ya da 22 (en fazla 50 ya da 200 mg / kg) 20,21 morfin dozları günlük yönetiminde oluşur. A, 8 günlük bir süre içinde, duruma göre, her gün morfin uygulamasından (sc 5 mg / kg) ile C57BL / 6 farelerinde hiperaljezi ve tolerans gelişimini teşvik etmiştir. Bu ılımlı morfin dozu daha iyi taklit klinik kullanım için daha yüksek olanlar tercih edilmiştir.
TİT operasyonel penceresinin kurmak
TİT bir muhtemel tuzak kemirgenler 26,37 arasında termoregülasyon kuyruk rolüne ilişkin olabilir. Ortam sıcaklığı nocicept önemli bir faktör olduğutepki ive varyasyonları, bu deneyler 38 boyunca (burada 21 ° C'de) sabit tutulması gerekmektedir. Isı yoğunluğu, genellikle 5 ila 10 saniye 27 içinde bir nosiseptif tepki algılamak için kuruldu. Kısa olanlar testin diferansiyel gücü azaltabilir oysa Nitekim, daha fazla gecikmeleri, nosiseptif uyarana ilgisi olmayan hayvan hareketlerinin izlenmesi için riskini artırabilir. Bu 48 ° C sabit bir sıcaklıkta TIT ölçümleri gerçekleştirildi Kuyruk çekme gecikmeleri 9 sn (bazal nosiseptif değer) yakındır ve 25 sn 4 sn (hiperaljezi) den farklı idi (maksimal analjezi; kesti). Pratik nedenlerle ek olarak, sabit bir sıcaklıkta nosiseptif tepki değerlerinin ölçümleri önsel böylece veri yorumlama kolaylaştıran, nosiseptörlerin ve devrelerin aynı repertuar içerebilir.
Olası Değişiklikler
Analjezi ve OIH ölçü için TIT işletme penceresinin optimizasyonuNTS
Analjezik yanıt odaklanırken, düşük bazal değerleri (yüksek ısı yoğunluğu) karşılık olarak bir gecikme tespiti lehine olabilir. Şekil 4, daha hızlı yanıt saptanmasını kolaylaştırabilir; Buna karşılık, bir ağrılı uyarıcı sonucu veya OIH gelişimini, daha yüksek taban çizgisi değerlerine (burada 48 ° C daha düşük bir ısı yoğunluk) gidermek için.
Morfin kaynaklı analjezi,: (Kritik adım önce belirtildiği gibi 5 mg morfin bulundu rağmen / güçlü bir analjezik yanıtı Şekil 3 ikna etmek ve (tekrarlanan uygulama üzerine) önemli hiperestezisi Şekil 4 tanıtmak için uygun bir doz kg, kendi dozaj adapte edilebilir hiperaljezi ve tolerans). Örneğin, daha düşük dozlar, daha yüksek dozların hiperaljezi başlangıcını hızlandırmak ve arttırmak için genlik seçilebilir ise (bu cut-off kısıtlamaları ortadan kaldırır) analjezi genlik azaltmak için kullanılabilir.
OveRall, 'nosiseptif pencerenin' optimizasyon çalışmanın altında farelerin genetik arka uyarlanmış ve dikkate Nosiseptörlerin ve devrelerin farklı dizilerin katılımı için olasılığı dikkate alınmalıdır.
Alternatif uyuşturucu agonistleri (fentanil, remifentanil)
En çok klinik olarak kullanılan afyon agonistleri olarak mu-opioid reseptörü hedef de, in vitro ve in vivo olarak farmakolojik özellikleri açısından önemli ölçüde farklılık göstermektedir. Örneğin, remifentanil ve fentanil için, morfin ile işaretlenmiş aksine, tam agonistler olarak davranırlar ve mu-opioid reseptörlerinin 39 içselleşmesini teşvik. Remifentanil birkaç dakika 41 ultra kısa bir yarı ömre sahiptir ise morfin ve fentanil gibi opium harici analjezikler, 40 saat aralığında yarı ömre sahiptir. İnsanlarda, OIH için en iyi kanıt, kısa etkili c olmak üzere, ameliyat sırasında afyon alınan hastaların birgibi remifentanil 2,42 gibi iyodu. Böylece, fentanil ve remifentanil TİT ve TPT paradigmalar altında, farelerde Hiperaljezi ve hoşgörü gelişimini incelemek için çok değerli araçlar olabilir.
OIH indüksiyonu alternatif modları (akut uygulama vs kronik)
OIH çok düşük ya da çok yüksek dozlarda 1,2 olsun, opiat tatbikat bir sonucu olarak, insan ve hayvan modellerinde görülmektedir. Biz morfin ılımlı dozda farelerin kronik tedavisi sonrasında OIH gelişimi burada rapor. . C57BL/6N farelerin tedavisi için birkaç gün 4 günlük morfin enjeksiyonu yeterli implante morfin granül ile değiştirilebilir bir berrak ve tekrarlanabilir bir durum Şekil hiperaljezik kanıt için gerekli olmuştur: çıkarılması üzerine, termal hiperaljezi ve allodini, mekanik hem de daha önce farelerde bildirilmiştir 43. Bir mikro-ozmotik pompası ile afyon infüzyonu başka bir olasılıktır 44. Kemirgenlerde, uzun süreli hiperaljezi de elde insan cerrahisinde 36,45,46 bu mu-opioid agonistinin kullanımını taklit eden bir protokol kullanılarak fentanil akut verilmesini takip etmektedir.
Tekniğin Sınırlamalar
Ağrı için hayvan türleri ve modelleri
Çok sayıda fare suşlarının karşılaştırmalı çalışmalar 4-gün tedavi, morfin, aşağıdaki 22 ağrılı uyaranlara 17,31,47 nosiseptif yanıtlarında ve OIH düzeylerinde büyük varyasyonlar için kanıt sağladı. Hayvan modellerinde (fareler ve sıçanlar) ağrı işleme ve modülasyon yatan mekanizmaları kronik ağrı hastalar için uygun olup olmadığını ve temel bir açıldı bir soru kalır. Böylece, çok dikkatli insanlar 16 hayvan verilerinin yorumlanması ve tahmin geçerlilik dikkat edilmelidir.
Ağrı ve analjezi Cinsiyet farklılıkları,
ntent "> ağrı için hayvan modelleri üzerinde en çok klinik öncesi çalışmalar, bu seçim yanlılığı rağmen, ortaya çıkan görünüm opioidi geliştirmek için opiat analjezikler 49,50, az yatkındır daha iyi yanıt olarak erkeği dikkate oldu. erkek kemirgenler 16,25,48 tarihinde yapılmıştır hiperaljeziyi 51,52 ve kadın meslektaşları (yorum 54) daha morfin analjezi 53 daha hoşgörülü kaynaklı. Ancak, nosisepsiyonun ve analjezik ilaçlar etkinliği açısından cinsiyet farkı böyle de devam etmeyin paradigma ', bir tek beden herkese uyar'. Nitekim, veri zenginliği şimdi çok sayıda değişkenler gibi opioid ilaç etkinliği ve seçicilik, nosiseptif deneyde, genetik arka plan, yaş, gonado-hormonal durum ya da sosyal etkileşim 48,54 olarak cinsiyet farklılıkları büyüklüğünü ve yönünü etkileyebilir gösterir. İnsanlarda klinik ağrı kadınlarda daha yaygın olduğunu, ancak bu gerçeği gerçek cinsiyet farklılıklarını yansıtan olmadığını tartışma 48,55,56 bir konudur. Fometa-analizler kadınlarda 57 bir anlamlı olarak daha fazla opioid etkinliğine işaret hastalar kontrollü konularda gerçekleştirilen oysa r örnek, elli klinik çalışmaların global analiz cinsiyetler arasında analjezik özelliklerinde anlamlı bir fark bulunmuştur. belirgin olmuştur ne tezat ikinci gözlem, kemirgenlerde bulunan, yine böyle ayrılıklar 16,48,55,57 için kökeni ile ilgili çeşitli sorular ortaya çıkarmaktadır. Toplamda, analjezi cinsiyet farklılıkları var ve liyakat daha altta yatan mekanizmaları ve klinik etkileri üzerinde durulmaktadır.Nosiseptif testler hakkında
Kuyruk çekme testi spinal refleks ama supraspinal etkilere 58. tabi olabilir. TİT sıçanlar üzerinde gerçekleştirmek için nispeten kolay ama farelerde daha fazla uzmanlık gerektirir. Bir potansiyel zorluk istenmeyen stres yaratmadan doğru bir duruş içinde fare korumaktır. Önerilen protokolüne uygun olarak ayarlanabilirkohort boyutu. 16 hayvan (8 kontrol ve tedavi gören 8) kolayca kadar bazal nosiseptif tepki değerlerinin ölçümü olarak (birinci TIT kullanarak, daha sonra farelerin tüm dizi için TPT) endişe altında yönetilmektedir. Analjezi süresi dersleri izleme kazandırdığı zaman aralığı (burada 30 dakika) içinde kesin bir zaman çizelgesinin kurulması ve (sonra ilk TİT, TPT) test edilebilir hayvanların maksimum sayısının değerlendirilmesini gerektirir. Hayvanların bütün kohort böylece deneyi kinetik sınırlamaları saygı izin vermek için alt gruplara ayrılabilir.
Mevcut / Alternatif Yöntemler ile ilgili Tekniğinin Önemi
OIH fare karşı farelerde
Sıçanlar yaygın akut ya da kronik bir opiat uygulama 46,59-61 ardından, opioid analjezik, hiperaljezi ve tolerans incelemek için kullanılmıştır. Gerçekten de, birkaç pratik nedenlerden dolayı, üstün olarak kabul edilebilirağrı deneyler 16,61 için bir hayvan modeli olarak farenin. Bununla birlikte, yakın zamana kadar, genetik olarak tadil edilmiş farelerin üretimi basit bir işlem değildi. Çok sayıda genetiği değiştirilmiş fare suşları zaten mevcut olduğundan, bizim modeli farelerde OIH ve tolerans gelişiminde çok sayıda bireysel genlerin katkısını incelemek için bir fırsat sunuyor.
Diğer nosiseptif testler karşı TİT ve TPT
TIT tail flick test uyarımı alanı olan en belirgin fark bir çeşididir. Radyant ısı ile aksine, sıcak suya daldırma ile kuyruğun sıcaklığında hızlı ve düzgün bir artışa yol açar. Termal ağrı testi (sıcak levha veya Hargreaves testleri) diğer formları ile karşılaştırıldığında, TİT genelinde ve konular içinde hem de oldukça tekrarlanabilir sonuçlar sağlar.
TPT muhtemelen içeren mekanik nosisepsiyonun 26,27,35 çalışma için çok popüler bir testtirayrı nosiseptif lifler ve moleküler dönüştürücüler ardından TIT 32. Bu hızlı ve güvenilir ölçümler 59 sağlar ama deneyci ve büyük hayvan kohortlar bazı uzmanlık gerektirir. Bu çalışmada, diğer prosedürler veya aygıtta kullanılan analjezimetre bir alternatif olarak gerginlik ölçme dayanarak (inceleme 27) varolur. TPT von Frey filamentleri genellikle mekanik allodynia'yı (yorum 27) değerlendirmek için alınır ise mekanik hiperaljeziyi eğitim için uygundur.
Bu Tekniği Mastering sonra Gelecekteki Uygulamalar veya Tarifleri
Burada mevcut deney OIH / tolerans modeli benzer ağrı modülasyonunda tek tek genlerin rolünü değerlendirmek amacıyla genetik olarak modifiye edilmiş fareler için adapte edilebilir. Ayrıca kronik ağrıyı gidermek için potansiyel terapötik maddelerin etkinliğini araştırmak için bir model sistem sağlar.
The authors have nothing to disclose.
Biz Dr JL teşekkür ederiz. Galzi (UMR7242 CNRS, Illkirch, Fransa) verdiği destek için.
Bu çalışma CNRS, İNSERM, Université de Strasbourg, Alsace BioValley tarafından ve Conectus, Agence National de la Recherche (ANR 08 EBIO 014.02) hibe tarafından desteklenmiştir Conseil Régional d'Alsace (Pharmadol), Communauté Urbaine de Strasbourg (Pharmadol), ICFRC (Pharmadol), OSEO (Pharmadol), Yön Générale des Entreprises (Pharmadol).
Name | Company | Catalog Number | Comments/description |
C57BL/6N Tac mice | Taconic, Ry, Denmark | C57BL/6N Tac B6-M | Male mice (25-30g) |
Morphine hydrochloride | Francopia, Paris, France | CAS n° 52-26-6 | Delivered with special authorization |
Syringes (Terumo) | Dutscher, Brumath, France | 050000 | Polypropylene; Sterile; Volume : 1 ml |
Needles (Terumo) | Dutscher, Brumath, France | 050101 | G26 ½ (Terumo reference : NN2613RO1) |
Mouse restrainer | Home-made | – | Two metallic grids (5x11cm) assembled with adhesive tape and staples. |
Thermostated water bath GR150 | Grant Instruments, Cambridge, UK | GP 0540003 | |
Analgesimeter | Panlab, Barcelona, Spain | LE 7306 | |
Kaleidagraph software | Synergy software, Reading, PA, USA | Kaleidagraph 4.03 | Scientific graphing |
STATview software | Free download; Statistics |