우리는 아편 유발 통각 과민과 생쥐의 관용의 개발을 검토하는 프로토콜을 설명합니다. 순진과 모르핀 처리 된 동물의 열 및 기계적 통각 반응의 측정을 바탕으로, 그것은 고통의 감도 (통각 과민)의 증가를 정량화 및 만성 아편 관리와 관련된 진통제 (허용 오차)이 감소 할 수 있습니다.
아편 유발 통각 과민과 허용 오차는 심각하게 동물과 인간의 진통제로 약물의 임상 효능에 영향을 미칠. 두 현상의 근간이되는 분자 메커니즘이 잘 이해되지 않고 자신의 해명이 동물 모델의 연구에서 적절한 실험 프로토콜의 설계에서 수혜가 예상된다.
우리는 여기에서, 유도 기록하고 야생형 생쥐의 꼬리 침수와 꼬리 압력 테스트를 사용하여, 진통제 내성을 증명뿐만 아니라 모르핀에 의한 통각 과민을 정량화하기위한 방법 론적 접근 방식을 설명합니다. 영상에 도시 된 바와 같이, 프로토콜은 오 순차 단계로 분할된다. 취급 및 습관화 단계는 동물의 기초 통각 반응의 안전한 결정을 할 수 있습니다. 모두 열 및 기계적 감도의 증가로 같이 만성 모르핀의 투여는 상당한 통각 과민을 유도하는 반면, 후 진통 시간 과정의 비교 급성 또는 담당자어갈 모르핀 치료는 분명 진통 응답 진폭의 감소에 의해 각성 관용의 개발을 나타냅니다. 이 프로토콜은 마찬가지로 통각 모르핀 진통제의 변조의 개별 유전자의 역할을 평가하기 위해 유전자 변형 마우스에 적응 될 수있다. 또한 아편 진통 효능을 향상시키는 잠재적 인 치료제의 효과를 조사하기 위해 모델 시스템을 제공한다.
아편 유발 통각 과민 (OIH) 및 진통 허용 오차는 동물과 인간 1-3 약물의 임상 적 효능을 제한 할 수 있습니다. 염증성 4,5 또는 프로 통각 (안티 아편) 6,7 시스템의 참여는 현재 가설을 탐구하고 있습니다. OIH 관용 근본적인 메커니즘의 해명은 적절한 동물 모델 실험 프로토콜 및 분자 도구를 사용하여 생체 내 및 생체 외 접근법에서의 조합을 필요로한다.
행동 약리학 실험실 동물의 진통과 hyperalgesic 상태를 모니터링하고 정량화하는 지배적 인 패러다임 (쥐, 마우스)입니다. 동물의 편리한 본체 부품 (뒷발, 꼬리)에 유해 자극 (열 기계 또는 화학 물질)의 응용 프로그램을 쉽게 획득 할 수있는 nocifensive 철수로 연결됩니다.
우리는 OIH을 유도 기록하고 정량화 여기에 방법 론적 접근 방식을 제안하고꼬리 침수와 꼬리 압력 테스트를 사용하여 야생형 생쥐의 허용 오차. 절차는 마우스에서 열 및 기계적 통각 응답 값의 쉬운 민감하고 재현성있는 측정을 허용한다. 비디오 프로토콜에서와 같이, C57BL / 6 마우스는 만성 모르핀 투여 중요한 통각 과민을 경험하고 몇 일 동안이를 유지한다. 모두 열 및 기계적 통각 값은 상당히 순진 동물에 대한 기준 측정에 비해 감소된다. 또한, 우리의 실험 장치는 OIH, 모르핀 (허용 오차)에 진통 응답의 감소의 개발뿐만 아니라, 모니터링 할 수 있습니다. 발표 자료는이이 문학 1,10-12에 이의를 제기하고 있지만 통각 과민과 관용, 일반 세포와 분자 메커니즘 8,9를 포함 할 수 있다는 견해를 지원합니다. 마지막으로,이 프로토콜은 유사 모듈라 개별 유전자의 역할을 평가하기 위해 유전자 변형 마우스에 적응 될 수있다고통의 기. 또한 아편 진통 효과를 향상시키기 위해 잠재적 치료제의 효과를 평가하기위한 모델 시스템을 제공한다.
중요한 단계
통각 측정을위한 동물 모델의 선택
쥐의 변종들 통각과 진통 감도의 변화가 원인이 상이한 다양한 통증 모델을 사용 (이용 후기 14 ~ 16) 리뷰를 검토 한 (통각을, 염증, 신경 병증), 양상 (열, 화학, 기계), 지속 시간 (급성, 토닉, 만성) 및 관리 사이트 (피부, 피하, 내장). 다른 균주에 비해 그들이 높은 기저 통각 감도 17, 18 및 약물 14,19에 적당한 진통 응답을 전시로, C57BL/6J 마우스 (잭슨 연구소에 대해 "J")는 통증 연구를위한 인기있는 동물 모델이되었다. 만성 모르핀 치료에 따라, 그들은 또한 상당한 진통 허용 오차 20, 21, 21, 22, 통각 과민과 의존 20,23을 개발한다.
NT "> 여기에서, 실험은 C57BL/6N 사탕 마우스에 수행 된 B6 혈통의 별도의 지점에 속한다 ("Taconics 팜 전술 ' "국민 건강의 연구소에 대해"N). C57BL / 6 마우스가 오래되어 있지만 교환, 최근의 연구는 C57BL/6J 및 C57BL/6N 24 균주 중 중요한 행동의 차이를 지적으로 간주. 특히, 열 통증이 급성하기 (사탕 하나를 포함한다)의 세 C57BL/6N의 substrains의 낮은 감도로 간주 될 수있다 이러한 표현형을 테스트하는 이점.수컷 마우스는 청소년 수컷 25에서 수행되는, 동물 모델로서 쥐를 사용하여 통증 연구의 대부분으로서 선택 하였다. 보기의 진통제 또는 통각 과민 지점에서 검사를 할 때 우리의 손에, 그들은 강력하고 재현 가능한 데이터를 제공했습니다. 때때로, 우리는 C57BL/6N의 여성은 TIT와 TPT 테스트 모두에서 더 많은 변수 응답을 제공하는 경향이 나타났습니다. 이 관찰은 할 수 있지만여성의 호르몬 상태에 연결된 자연의 변화를 반영, 통증과 진통제에 섹스의 차이를 기본 전반적인 메커니즘은 여전히 논쟁의 문제가 남아있다. 이 뜨거운 논쟁의 일부 측면은 간단히 섹션 다음 '기술의 한계'에 제출 될 것입니다.
동물 습관화
마우스는 첫 번째 주에 동물 시설에 익숙해 질 수 있었다. 다른 행동 연구와 마찬가지로, 테스트는 3 일간 – 적응 기간 (그림 1, 단계 A) 다음을 수행 하였다. 통각 검사가 스트레스에 민감한으로, 첫 번째 조치는 특히 비 길들여 마우스 (26, 27)에, 이후의 것들보다 더 긴 대기 시간을 제공 할 수 있습니다. 습관화 단계는 동일 일 이내 및 일 간의보다 안정적인 통각 반응 값의 obtention 2 및도 4를 피규어 허용한다. 통각과 진통에 효과주기를 줄이기 위해감도 28, 29, 모든 testings를은 오전 10시에서 오후 4시까지 실시했다.
통각 검사의 선택
통각 검사는 열, 기계적, 화학적 또는 전기적 자극 (리뷰 26,27,30. 다른 통각 양식이 다른 침해 수용체 섬유 18,31,32를 통해 처리 할 수 있으므로 자신의 선택이 중요한 하나를 사용하십시오.
우리는 열의 예로서 랜달과 Selitto 35에서 적응 꼬리 침지 시험 (TIT) (33), D' 아무르 스미스 (34)에 의해 개발 된 고전적인 꼬리 영화 테스트의 수정 된 버전, 꼬리 압력 시험 (TPT)를 선택하고 쥐에 모르핀 유발 진통제, 통각 과민과 관용을 연구하는 기계 양식. 두 시험은 널리 쥐에 사용되었습니다. 차단 시간을 체계적으로 조직 손상의 위험을 방지하거나 제한하기 위해 정의되었다.
모르핀 인덕턴스에드 진통제, 통각 과민과 관용
그것은 강력한 진통제와 OIH – 유도 그대로 모르핀, 원형 뮤 아편 작용제는 인간과 쥐 1,2,36 모두, 여기에 선정되었다. 모르핀의 진통 효능은 쥐의 변종, 투여 경로 및 통각 양식에 따라 변화하는 것으로 알려져 있습니다. C57BL / 6 마우스에서 안정적인 진통은 보통 1-20 ㎎ / kg의 투여 량 범위에서 14,21 모르핀 피하 주사 다음이 얻어진다. 따라서, 우리는 열 통각 (19, 21)에서 평가의 ED 50 값 (7-20 ㎎ / ㎏)에 가까운 5 ㎎ / ㎏,에서 모르핀의 단일 관리 (SC) 다음과 같은 심각한 진통을 공부하기로 결정했습니다.
반복 모르핀 투여 자주 통각 과민 (고통스러운 STIMUL에 악화 감도 (용량 – 반응 곡선의 우측 이동 또는 진통제 응답 진폭 또는 지속 시간의 감소에서 하나 입증) 진통제 내성과 함께합니다i)는 기저 통각 값이 감소 입증. 두 불리한 현상은 치료 기간에과 통각 양식 21 아편 선택 화합물 및 투여 량의 자연, 설치류의 변종에 따라 다릅니다. 예를 들어, 관용과 통각 과민을 연구하는 실험 패러다임은 일정한 고 (하루 20 ~ 40 ㎎ / ㎏)의 22 또는 (최대 50 또는 200 ㎎ / ㎏) 20, 21 모르핀의 투여 량을 고조의 일상 관리에 구성되어 있습니다. 8 일 동안, 따라서, 우리는 매일 모르핀 관리 (SC 5 ㎎ / ㎏)를 통해 C57BL / 6 마우스에서 통각 과민과 관용의 개발을 촉진. 이 정도 모르핀의 투여 량은 더 나은 모방 클리닉 사용에 더 높은 것보다 선호했다.
TIT 운영 윈도우의 설정
TIT에서 가능한 함정은 설치류 26,37의 체온 조절에 꼬리의 역할과 관련이있을 수 있습니다. 주위 온도가 nocicept에 중요한 요소이기 때문에응답 변화를 필자, 그것은 실험 38을 통해 (여기에 21 ° C에서) 일정하게 유지되어야한다. 열 강도는 보통 5 ~ 10 초 27에서 통각 반응을 감지하도록 설정되어 있습니다. 짧은 것들은 시험의 차분 전력을 감소시킬 수있는 반면 실제로, 큰 지연은 침해 수용성 자극에 관계없는 동물의 움직임을 모니터링하기 위해 위험을 증가시킬 수있다. 우리는 48 ° C의 온도를 일정에 TIT 측정을 수행 꼬리 탈퇴 대기 시간이 9 초 (기초 통각 값)에 가까운 25 초 4 초 (통각 과민)에서 변화했다 (최대 진통제, 차단). 실질적인 이유에 더하여, 고정 온도에서 통각 반응 값의 측정은 선험적함으로써 데이터 해석을 용이 침해 수용체 및 회로의 동일한 레퍼토리를 수반 할 수있다.
가능한 수정
진통제와 OIH 방식 측정 TIT 운영 윈도우의 최적화국세청
진통 반응에 집중하면, 낮은 초기 값 (높은 열 강도) 응답 지연의 검출을 선호 할 수 있습니다. 그림 4 빠른 응답의 검출을 용이하게 할 수있다, 차례 차례로, 고통스러운 자극의 결과 또는 OIH의 개발, 높은 초기 값 (여기에 48 ° C 낮은 열 강도)를 해결하기 위해.
모르핀 유발 진통제, (중요한 단계 이전에 언급 한 바와 같이 우리는 5 밀리그램에서 모르핀을 찾을 수 있지만, / 강력한 진통제 응답 그림 3을 유도하고 (반복 투여시) 중요한 통각 과민 그림 4를 촉진하기 편리한 용량을 kg, 그 용량은 구성 될 수있다 통각 과민과 관용). 예를 들어, 더 낮은 복용량은 고용량이 통각 과민의 발병을 촉진하고 그 진폭을 증가시키기 위해 선택 될 수있는 반면 (이를 차단 제한을 피하는) 진통제 진폭을 감소시키기 위해 사용될 수있다.
비켜rall, '통각 창'의 최적화 연구에서 생쥐의 유전 적 배경에 적응하고 계정에 침해 수용체 및 회로의 독특한 배열의 참여에 대한 가능성을해야합니다.
대체 아편 작용제 (펜타닐, remifentanyl)
대부분의 임상 적으로 사용이 아편 작용제로서 MU-오피오이드 수용체를 표적으로하지만, 이들은 시험 관내 및 생체 내 둘 다 그들의 약리학 적 특성에 대하여 상당히 다르다. 예를 들어, remifentanyl 및 펜타닐의 경우, 모르핀으로 표시 대조적으로 전체 작용제 행동 및 뮤 – 오피오이드 수용체 (39)의 국제화를 촉진한다. remifentanyl 몇 분 (41)의 매우 짧은 반감기를 가지고있는 동안 모르핀과 펜타닐 등 아편 진통제는 시간 40의 범위에서 반감기가 있습니다. 인간, OIH에 대한 최고의 증거는 짧은 연기 C를 포함하여, 수술 중 마취를받은 환자에서입니다같은 remifentanyl 2,42으로 ompounds. 따라서, 펜타닐과 remifentanyl는 TIT 및 TPT 패러다임에서 생쥐의 통각 과민과 관용의 개발을 연구 너무 가치있는 도구가 될 수 있습니다.
OIH의 유도의 대체 모드 (급성 관리 대 만성)
OIH은 매우 낮거나 매우 높은 복용량 1,2의 여부, 마취 관리의 결과로 인간과 동물 모델에서 볼 수있다. 우리는 모르핀의 적당한 용량과 생쥐의 만성 치료 다음 OIH 개발에보고한다. . C57BL/6N 마우스의 치료의 여러 가지 일 4 일간 모르핀 주사를 적절하게 이식 모르핀 펠릿으로 대체 될 수있는 명확하고 재현 hyperalgesic 상태도 증거가 필요했다 : 자신의 제거시를, 열 통각 과민 및 기계적 이질통 모두 이미 생쥐에서보고 된 바있다 43. 마이크로 침투 펌프를 통해 약물의 주입은 또 다른 가능성이다 44. 설치류에서 오래 지속되는 통각 과민도 달성 할 수있는 인간의 수술 36,45,46이 뮤 – 오피오이드 길항제의 사용을 흉내 낸 프로토콜을 사용하여 펜타닐의 급성 관리를 수행한다.
기술의 한계
통증에 대한 동물 종 및 모델
수많은 마우스 종자의 비교 연구는 4 일 모르핀 치료 22 다음과 같은 고통스러운 자극 17,31,47에 통각 반응과 OIH 수준에서 큰 변화에 대한 증거를 제공했다. 동물 모델 (쥐 및 쥐)에 통증 처리 및 변조를 기본 메커니즘은 만성 통증 환자에 대한 관련이 있는지 여부는 근본적인 열린 질문 남아있다. 따라서, 많은주의는 인간 16 동물을위한 데이터의 해석과 자신의 예측 타당성에 지불해야한다.
통증과 진통제에 성별 차이
ntent "> 통증 동물 모델에서 대부분의 임상 연구는이 선택의 편견에도 불구하고, 새로운 뷰가 아편을 개발하기 위해 아편 진통제 49,50, 적은 경향이 더 나은 조치로 남성을 고려하는 것이 었습니다. 남성 설치류 16,25,48에 진행되고있다 통각 과민 (51, 52)와 자신의 여성 대응 (리뷰 54)보다 모르핀 진통제 53 관대를 유도. 그러나, 통각 및 진통제의 효능에 관해서는 성별 차이는 재개하지 패러다임 '한 사이즈 것은 모두를 적합'. 사실, 풍부한 데이터는 이제 수많은 변수는 오피오이드 약물 효능 및 선택성, 통각 분석, 유전 적 배경, 나이, gonado 호르몬 상태 나 사회적 상호 작용 48,54 같은 성별 차이의 크기와 방향에 영향을 미칠 수 있음을 나타냅니다. 인간, 임상 통증 여성에서 더 유행하지만,이 사실은 실제 섹스의 차이를 반영하는지 여부를 토론 48,55,56의 문제가 남아있다. FO메타 분석은 여성 (57)의 상당히 큰 아편 효능을 지적 환자 제어 과목에서 수행하는 반면 R 예, 오십 임상 시험의 글로벌 분석은 성별 간의 진통에 유의 한 차이를 표시하지 않습니다. 현저하게 된 내용과 대조 후자의 관찰, 설치류에서 발견, 다시 같은 다방면의 16,48,55,57의 기원에 관한 몇 가지 질문을 제기한다. 전부, 진통제의 성별 차이가 존재하고 장점은 더욱 근본적인 메커니즘과 임상 적 의미에 초점을 맞 춥니 다.통각 테스트에 대한
꼬리 탈퇴 시험은 척수 반사이지만 supraspinal 영향 (58)의 적용을받을 수 있습니다. TIT 쥐에서 수행하기가 비교적 용이하지만, 마우스에 더 많은 전문 지식이 필요합니다. 잠재적 인 어려움은 원치 않는 스트레스를 유발하지 않고 올바른 자세로 마우스를 유지하는 것이다. 제안 된 프로토콜에 따라 조절 될 수있다코호트의 크기. 16 동물 (8 제어 및 8 처리) 쉽게까지 자신의 기초 통각 반응 값의 측정으로 (처음 TIT를 사용하여, 다음 마우스의 전체 시리즈를위한 TPT)이 관심을 받고있다 관리됩니다. 진통 시간의 과정을 모니터링 이수 시간 간격 (여기에서 30 분) 내에서 정확한 시간 일정의 설립 및 (먼저 TIT, TPT) 테스트 할 수 있습니다 동물의 최대 수의 평가를 필요로한다. 동물의 전체 코호트 따라서 실험자가 운동 제한을 준수 할 수 있도록 서브 그룹으로 분할 될 수있다.
기존 / 대체 방법에 대한 기술의 중요성
OIH 마우스 대 쥐
쥐 광범위하게 급성 또는 만성 아편 관리 46,59-61 다음, 아편 유사 진통제, 통각 과민과 관용을 연구하는 데 사용되었습니다. 실제로, 몇몇 실제적인 이유로, 이들은 우수한 것으로 간주 될 수있다통증 실험 16,61위한 동물 모델로 쥐. 그러나, 최근까지, 유 전적으로 변형 된 쥐의 생성은 간단 절차 아니었다. 수많은 유전자 변형 마우스 종자는 이미 사용할 수 있습니다, 우리의 모델 마우스에 OIH와 관용의 개발에 다수의 개별 유전자의 기여를 연구 할 수있는 기회를 제공합니다.
다른 통각 검사 대 TIT 및 TPT
TIT는 꼬리 영화 테스트, 자극의 영역 인 가장 명백한 차이의 변종이다. 복사열과는 대조적으로, 뜨거운 물에 꼬리의 침수의 온도에서 신속하고 균일 한 증가로 연결됩니다. 열 통각 검사 (핫 플레이트 또는 하그리브스 시험)의 다른 형태에 비해, 가슴을 가로 질러과 과목에서 모두 상당히 재현 가능한 결과를 제공합니다.
TPT 아마 포함 기계적 통각 26,27,35의 연구를위한 매우 인기있는 시험입니다별개의 통각 섬유 및 분자 트랜스 듀서 다음 TIT 32. 그것은 빠르고 신뢰할 수있는 측정 59을 제공하지만 실험 및 대형 동물 동료의 전문 지식이 필요합니다. 본 연구 결과, 다른 절차 나 장치에 사용 analgesimeter에 대한 대안으로 스트레인 게이지에 의존하는 (리뷰 27) 존재한다. TPT는 본 프레이 필라멘트는 일반적으로 기계적 이질통 (리뷰 27)을 평가하기 위해 수행되는 반면 기계적 통각 과민을 공부에 가장 적합합니다.
이 기술을 마스터 한 후 미래의 응용 프로그램 또는 방향
우리는 여기에 제시 실험 OIH / 오차 모델은 유사 통증 변조의 개별 유전자의 역할을 평가하기 위해 유전자 변형 마우스에 적응 될 수있다. 또한, 만성 통증을 완화하는 전위 치료제의 효과를 조사하기 위해 모델 시스템을 제공한다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 박사 JL 감사합니다. Galzi (UMR7242 CNRS, 스트라스부르, 프랑스) 자신의 지원.
이 작품은 CNRS, INSERM, Université 드 스트라스부르, 알자스 바이오 밸리에 의해 Conectus, 직원은 국립 드 라 공들인 (ANR 08 EBIO 014.02)에서 교부금에 의해 지원 된 헌법위원회 지역 달자 (Pharmadol), Communauté 어바인 드 스트라스부르 (Pharmadol) ICFRC (Pharmadol), OSEO (Pharmadol), 방향 제네랄 데 ENTREPRISES (Pharmadol).
Name | Company | Catalog Number | Comments/description |
C57BL/6N Tac mice | Taconic, Ry, Denmark | C57BL/6N Tac B6-M | Male mice (25-30g) |
Morphine hydrochloride | Francopia, Paris, France | CAS n° 52-26-6 | Delivered with special authorization |
Syringes (Terumo) | Dutscher, Brumath, France | 050000 | Polypropylene; Sterile; Volume : 1 ml |
Needles (Terumo) | Dutscher, Brumath, France | 050101 | G26 ½ (Terumo reference : NN2613RO1) |
Mouse restrainer | Home-made | – | Two metallic grids (5x11cm) assembled with adhesive tape and staples. |
Thermostated water bath GR150 | Grant Instruments, Cambridge, UK | GP 0540003 | |
Analgesimeter | Panlab, Barcelona, Spain | LE 7306 | |
Kaleidagraph software | Synergy software, Reading, PA, USA | Kaleidagraph 4.03 | Scientific graphing |
STATview software | Free download; Statistics |