Nous décrivons un protocole pour examiner l'évolution de l'hyperalgésie et de tolérance chez les souris induite par les opioïdes. Sur la base de la mesure des réponses nociceptifs thermiques et mécaniques des animaux naïfs et traités par la morphine, il permet de quantifier l'augmentation de la sensibilité à la douleur (hyperalgie) et diminuer de l'analgésie (tolérance) associée à l'administration d'opiacés chronique.
Hyperalgésie et la tolérance induite par les opioïdes un impact fortement l'efficacité clinique des opiacés analgésiques chez les animaux et les humains. Les mécanismes moléculaires qui sous-tendent les deux phénomènes ne sont pas bien compris et leur élucidation devraient bénéficier de l'étude de modèles animaux et de la conception de protocoles expérimentaux appropriés.
Nous décrivons ici une approche méthodologique pour induire, d'enregistrement et de quantifier l'hyperalgésie induite par la morphine ainsi que pour mettre en évidence la tolérance analgésique, en utilisant les tests de pression queue d'immersion et de la queue chez les souris de type sauvage. Comme le montre la vidéo, le protocole est divisé en cinq étapes séquentielles. Manipulation et habituation phases permettent une détermination sûre de la réponse nociceptive de base des animaux. L'administration chronique de morphine induit l'hyperalgésie significative comme le montre une augmentation à la fois la sensibilité thermique et mécanique, alors que la comparaison de temps-cours analgésie après aiguë ou reptraitement morphinique eated indique clairement le développement de la tolérance manifestée par une diminution de l'amplitude de la réponse analgésique. Ce protocole peut être adapté de manière similaire à des souris génétiquement modifiées afin d'évaluer le rôle des gènes individuels dans la modulation de la nociception et l'analgésie morphine. Il fournit également un système modèle pour étudier l'efficacité des agents thérapeutiques potentiels pour améliorer l'efficacité analgésique opiacé.
Hyperalgésie induite par les opioïdes (BSI) et la tolérance analgésique limitent l'efficacité clinique d'opiacés chez les animaux et les humains 1-3. La participation des pro-inflammatoire 4,5 ou de pro-nociceptives (anti-opioïde) 6,7 systèmes sont actuellement explorées hypothèses. L'élucidation des mécanismes sous-jacents BSI et la tolérance nécessite une combinaison in vivo et in vitro dans les approches, en utilisant des modèles animaux appropriés, des protocoles expérimentaux et des outils moléculaires.
Pharmacologie comportementale est le paradigme dominant de surveiller et quantifier les Etats analgésiques et hyperalgésiques des animaux de laboratoire (rats, souris). L'application d'un stimulus nociceptif (thermique, mécanique ou chimique) à une partie du corps commode (patte arrière, la queue) de l'animal conduit à un retrait nocifensive qui peut être facilement marqué.
Nous proposons ici une approche méthodologique pour induire, d'enregistrement et de quantifier BSI etla tolérance chez les souris de type sauvage, en utilisant les tests de pression queue d'immersion et de la queue. La procédure permet une détermination facile, sensible et reproductible des valeurs de réponse nociceptifs thermiques et mécaniques chez les souris. Comme démontré dans le protocole vidéo, souris C57BL / 6 hyperalgésie expérience significative après l'administration chronique de morphine et de maintenir ce pendant plusieurs jours. Les deux valeurs nociceptifs thermiques et mécaniques sont considérablement réduits par rapport aux mesures de référence sur les animaux naïfs. En outre, notre dispositif expérimental permet de contrôler, en plus de la mise au point de OIH, la baisse de la réponse analgésique de la morphine (tolérance). Les données présentées confirment que l'hyperalgésie et la tolérance peuvent impliquer des mécanismes cellulaires et moléculaires communs 8,9, bien que cela soit contesté dans la littérature 1,10-12. Enfin, ce protocole peut être adapté de manière similaire à des souris génétiquement modifiées afin d'évaluer le rôle des gènes individuels dans la modulationtion de la douleur. Elle fournit également un système modèle pour évaluer l'efficacité des agents thérapeutiques potentiels pour améliorer les effets analgésiques opiacés.
Étapes critiques
Choix du modèle animal pour des mesures de nociception
La variabilité de la sensibilité nociceptive et analgésique chez des souches de souris a été examiné (avis 14-16) avis en utilisant différents modèles de douleur différents dans leur étiologie (de nociceptifs, inflammatoire, neuropathique), la modalité (thermique, chimique, mécanique), la durée (aiguë, tonique, chronique) et le site d'administration (cutanée, sous-cutanée, viscérale). Par rapport à d'autres souches, C57BL/6J («J» pour Jackson Laboratory) souris est devenu un modèle animal populaire pour les études de la douleur car ils présentent une grande sensibilité nociceptive base 17,18 et une réponse analgésique modérée aux opiacés 14,19. Après le traitement chronique de morphine, ils développent également significative la tolérance analgésique 20,21, 21,22 et hyperalgésie dépendance 20,23.
nt "> Ici, les expériences ont été réalisées sur des souris C57BL/6N Tac (" N "pour l'Institut national de la santé et« Tac »pour Taconics ferme) qui appartiennent à une branche séparée de la lignée B6. Bien souris C57BL / 6 ont été longues considérés comme interchangeables, des études récentes ont souligné les différences de comportement significatives entre les souches C57BL/6J et C57BL/6N 24. En particulier, la faible sensibilité des trois sous-souches de C57BL/6N (y compris le Tac un) pour la douleur aiguë thermique peut être considéré comme un avantage pour tester ce phénotype.Les souris mâles ont été choisis comme la grande majorité des études sur la douleur, en utilisant des souris comme modèle animal, sont effectuées sur les jeunes mâles 25. Dans nos mains, ils ont fourni des données robuste et reproductible quand on l'examine du point de vue analgésie ou hyperalgésie. De temps en temps, nous avons remarqué une tendance chez les femmes C57BL/6N de fournir des réponses plus variables, à la fois dans le TIT et essais TPT. Bien que cette observation peutreflète les variations naturelles liées au statut hormonal des femmes, les mécanismes sous-jacents généraux différences entre les sexes dans la douleur et l'analgésie restent un sujet de controverse. Certains aspects de ce débat chaud seront brièvement présentées dans les prochaines «Limites de la technique" section.
habituation des animaux
Souris ont d'abord été autorisés à s'habituer à l'animalerie pendant une semaine. Comme pour tout autre étude comportementale, test a été effectué après une période de 3 jour d'acclimatation (Figure 1, étape A). Comme les tests nociceptifs sont sensibles au stress, premières mesures peuvent donner des temps de latence plus longues que les suivantes, en particulier chez les souris non-habitués 26,27. L'étape d'habituation permet également l'obtention de valeurs de réponses nociceptives plus stables au sein de la même journée et entre les jours Figures 2 et 4. Pour réduire les effets circadiens sur nociceptive et analgésiquesensibilité 28,29, tous les testings ont été menées 10h00-16h00.
Choix des essais nociceptifs
Des tests nociceptifs utilisent soit thermique, mécanique, des stimuli électriques (26,27,30 avis. Leur choix est essentiel que les différentes modalités nociceptifs peuvent être traitées par différents nocicepteurs et des fibres chimiques ou 18,31,32.
Nous avons choisi le test queue d'immersion (TIT) 33, une version modifiée de l'essai queue de film classique développé par D'amour et Smith 34, et le test de pression de queue (TPT), adapté de Randall et Selitto 35, à titre d'exemples de thermique et modalités mécaniques pour étudier l'analgésie induite par la morphine, l'hyperalgésie et de tolérance chez les souris. Les deux tests ont été largement utilisés chez les rats. Un temps coupée a été systématiquement défini pour éviter ou limiter le risque de dommages aux tissus.
Morphine-inductioned analgésie, l'hyperalgésie et de tolérance
La morphine, l'agoniste mu-opiacés prototype, a été choisi ici car il est un puissant analgésique et BSI-inducteur, à la fois chez les humains et les souris 1,2,36. Morphine puissance analgésique est connue pour varier avec des souches de souris, les voies d'administration et les modalités nociceptifs. En C57BL / 6, l'analgésie fiable est généralement obtenue après des injections sous-cutanées de morphine dans la gamme de dose 1-20 mg / kg 14,21. Par conséquent, nous avons choisi d'étudier l'analgésie aiguë après une seule administration (sc) de la morphine à 5 mg / kg, à proximité de l'ES 50 valeur (7-20 mg / kg) a évalué de nociception thermique 19,21.
Administration répétée de morphine est souvent accompagnée de la tolérance analgésique (en témoigne soit d'un déplacement vers la droite de la courbe dose-réponse ou d'une diminution de l'amplitude de la réponse analgésique ou la durée) et l'hyperalgésie (une sensibilité exacerbée à stimul douloureusei témoigne d'une diminution de la valeur basale nociceptive). Les deux phénomènes indésirables dépendent de souches de rongeurs, de la nature du composé opiacé, qui est choisi et son dosage, de la durée du traitement et sur les modalités nociceptifs 21. Par exemple, les paradigmes expérimentaux pour étudier la tolérance et de l'hyperalgésie consistent en une administration quotidienne d'une grande et constante (20 à 40 mg / kg par jour) 22 ou de l'escalade (jusqu'à 50 ou même 200 mg / kg) 20,21 doses de morphine. En conséquence, nous avons favorisé le développement de l'hyperalgésie et de tolérance chez des souris C57BL / 6 souris par l'administration de morphine par jour (5 mg / kg; sc) sur une période de 8 jours. Cette dose de morphine modérée a été préféré à ceux élevés à une meilleure utilisation de la clinique synoptique.
Mise en place de la fenêtre opérationnelle de TIT
Un piège possible dans TIT pourrait être liée au rôle de la queue dans la thermorégulation de rongeurs 26,37. Lorsque la température ambiante est un facteur clé dans nociceptive variations de réponse, elle doit être maintenue constante (ici à 21 ° C) tout au long des expériences 38. l'intensité de la chaleur est généralement mis en place pour détecter une réponse nociceptive dans 5 à 10 sec 27. En effet, plus les latences peuvent augmenter le risque pour la surveillance des mouvements d'animaux non liés à la stimulation nociceptive, tandis que les plus courtes peuvent réduire la puissance différentielle de l'essai. Nous avons effectué des mesures de TIT à une température fixe de 48 ° C. latences de retrait de la queue étaient près de 9 sec (valeur nociceptive basale) et varie de 4 sec (hyperalgésie) à 25 sec (analgésie maximale; coupé). En plus des raisons d'ordre pratique, la mesure des valeurs des réponses nociceptives, à une température déterminée peuvent impliquer a priori le même répertoire de nocicepteurs et des circuits, ce qui facilite l'interprétation des données.
Modifications possibles
Optimisation de la fenêtre opérationnelle de TIT pour l'analgésie et BSI MeasureMents
En se concentrant sur une réponse analgésique, de faibles valeurs de référence d'intensité plus élevée (de chaleur) peuvent favoriser la détection d'un retard dans la réponse. À son tour, à prendre la suite d'un stimulus douloureux ou le développement de BSI, des valeurs plus élevées de base (intensité de chaleur plus faible; ici 48 ° C) peut faciliter la détection des réponses plus rapides Figure 4.
Bien que nous avons trouvé morphine à 5 mg / kg une dose convenable pour induire une réponse analgésique solide Figure 3 et à promouvoir (lors de l'administration répétée) hyperalgésie significative la figure 4, la posologie peut être adaptée comme mentionné précédemment (étape critique: l'analgésie induite par la morphine, l'hyperalgésie et de tolérance). Par exemple, des doses plus faibles peuvent être utilisées pour réduire l'analgésie amplitude (ce qui évite les limitations de coupure), tandis que des doses plus élevées peuvent être choisis pour accélérer l'apparition d'hyperalgésie et d'augmenter son amplitude.
OveRall, l'optimisation de la «fenêtre nociceptive 'doit être adapté à l'arrière-plan génétique de la souris à l'étude et de prendre en compte la possibilité de la participation des réseaux distincts de nocicepteurs et des circuits.
Agonistes opiacés alternatifs (fentanyl, rémifentanyl)
Bien que les opiacés les plus utilisés cliniquement ciblent le récepteur mu-opioïde comme agonistes, ils diffèrent considérablement en ce qui concerne leurs propriétés pharmacologiques in vitro et in vivo. Par exemple, rémifentanyl et le fentanyl, en contraste marqué avec de la morphine, de se comporter comme des agonistes complets et de promouvoir l'internalisation des récepteurs mu-opioïdes 39. analgésiques opiacés tels que la morphine et le fentanyl ont des demi-vies de l'ordre de 40 heures, tandis que rémifentanyl a un ultra-courte demi-vie de quelques minutes 41. Chez l'homme, meilleure preuve de BSI est de patients qui ont reçu des opiacés pendant la chirurgie, y compris à action brève compounds tels que rémifentanyl 2,42. Ainsi, le fentanyl et rémifentanyl peuvent être des outils précieux aussi pour étudier le développement de l'hyperalgésie et de tolérance chez la souris, sous TIT et paradigmes TPT.
D'autres modes d'induction de BSI (chronique vs administration aiguë)
OIH est observée chez l'homme et des modèles animaux à la suite de l'administration d'opiacés, que ce soit à des doses très basses ou très élevées 1,2. Nous rapportons ici sur le développement de BSI après un traitement chronique de souris avec des doses modérées de morphine. Plusieurs jours de traitement de souris C57BL/6N étaient nécessaires pour prouver un état hyperalgique figure claire et reproductible 4 injections de morphine quotidiens pourraient être remplacés de manière adéquate avec des pastilles de morphine implantés:. Lors de leur enlèvement, les deux hyperalgésie thermique et l'allodynie mécanique ont déjà été signalés chez des souris 43. Infusion d'opiacés par une pompe micro-osmotique est une autre possibilité 44. Chez les rongeurs, l'hyperalgie de longue durée est également réalisable après administration aiguë de fentanyl en utilisant un protocole imitant l'utilisation de cet agoniste des récepteurs mu-opioïde pour la chirurgie humaine 36,45,46.
Limites de la technique
Les espèces animales et des modèles pour la douleur
Des études comparatives de nombreuses souches de souris ont fourni des preuves pour de grandes variations dans les réponses à des stimuli nociceptifs douloureux 17,31,47 et des niveaux BSI après le traitement de 4 jours morphine 22. Que mécanismes sous-jacents de traitement de la douleur et de la modulation dans des modèles animaux (souris et rats) sont pertinents pour les patients souffrant de douleur chronique reste une question fondamentale et ouvert. Ainsi, beaucoup de prudence devrait être accordée à l'interprétation des données sur les animaux et à leur validité prédictive pour l'homme 16.
Les différences de sexe dans la douleur et l'analgésie
ntent "> La plupart des études précliniques sur des modèles animaux de la douleur ont été menées sur les rongeurs mâles 16,25,48. Malgré ce biais de sélection, la vue émergente était d'examiner les hommes comme de meilleurs répondeurs au analgésiques opiacés 49,50, moins enclins à développer des opioïdes hyperalgésie 51,52 et plus tolérants à la morphine analgésie 53 que leurs homologues féminins (54) d'examen induite. Cependant, les différences de sexe en ce qui concerne la nociception et analgésiques efficacité ne reprennent pas dans ce "un one size fits all 'paradigme. effet, une foule de données indique maintenant que de nombreuses variables peuvent influencer l'ampleur et la direction des différences sexuelles comme opioïde l'efficacité des médicaments et de la sélectivité, essai nociceptif, fond génétique, l'âge, l'état de gonado-hormonal ou l'interaction sociale 48,54. Chez l'homme, la douleur clinique est plus fréquente chez les femmes, mais si ce fait reflète les différences de sexe réelles reste un sujet de débat 48,55,56. For exemple, une analyse globale de cinquante essais cliniques n'a révélé aucune différence significative dans les propriétés analgésiques entre les sexes alors que les méta-analyses effectuées sur des patients-sujets contrôlés souligné une une efficacité significativement supérieure aux opioïdes chez les femmes 57. Cette dernière observation, qui contraste nettement avec ce qui a été trouvée dans les rongeurs, soulève encore plusieurs questions quant à l'origine de telles divergences 16,48,55,57. Au total, les différences sexuelles dans l'analgésie existent et mérite se concentrent davantage sur les mécanismes sous-jacents et les implications cliniques.A propos des tests nociceptifs
Le test queue de retrait est un réflexe spinal, mais il peut être soumis à des influences supraspinales 58. TIT est relativement facile à réaliser sur des rats, mais nécessite plus de compétences chez les souris. Une difficulté potentielle est de maintenir la souris dans une posture correcte sans induire stress indésirables. Le protocole proposé peut être ajustée en fonction detaille de la cohorte. 16 animaux (8 contrôle et 8 traités) sont faciles à gérer autant que la mesure de leurs valeurs de réponse nociceptifs basales (utilisant TIT, alors TPT pour toute la série de souris) est en cours de préoccupation. Suivi des cours à temps analgésie nécessite la mise en place d'un calendrier précis et l'évaluation du nombre maximal d'animaux qui peuvent être testés (TIT d'abord, puis TPT) dans l'intervalle de temps impartie (ici 30 minutes). L'ensemble de la cohorte d'animaux peut ainsi être divisé en sous-groupes pour permettre à l'expérimentateur de respecter les limitations cinétiques.
Importance de la technique par rapport aux méthodes existantes / Autres
BSI chez le rat par rapport à la souris
Les rats ont été largement utilisés pour étudier l'analgésie opioïde, l'hyperalgésie et la tolérance, après l'administration d'opiacés aiguë ou chronique 46,59-61. En effet, pour plusieurs raisons pratiques, ils peuvent être considérés comme supérieurs ausouris comme un modèle animal pour des expériences de douleur 16,61. Cependant, jusqu'à récemment, la génération de rats génétiquement modifiés n'est pas une procédure simple. Comme souches de souris génétiquement modifiées nombreux sont déjà disponibles, notre modèle offre la possibilité d'étudier la contribution de nombreux gènes individuels dans BSI et le développement de la tolérance chez les souris.
TIT et TPT par rapport à d'autres tests nociceptifs
TIT est une variante du test de mouvement de la queue, la différence la plus évidente étant la zone de stimulation. Par contraste avec la chaleur rayonnante, l'immersion de la queue dans l'eau chaude mène à une augmentation rapide et uniforme de sa température. Comparé à d'autres formes de tests de nociception thermique (essais de plaque chaude ou Hargreaves), TIT donne des résultats assez reproductibles à la fois dans et entre les sujets.
TPT est un test très populaire pour l'étude de la nociception mécanique 26,27,35 qui implique probablementfibres nociceptives distinctes et transducteurs moléculaires alors TIT 32. Il fournit des mesures rapides et fiables 59 mais nécessite une certaine expertise de l'expérimentateur et de grandes cohortes d'animaux. Comme alternative à la analgésimètre utilisé dans la présente étude, d'autres procédures ou des appareils se fondant sur les jauges de contrainte existent (revue 27). TPT est le mieux adapté pour l'étude de l'hyperalgésie mécanique tandis que les filaments de von Frey sont généralement prises pour évaluer l'allodynie mécanique (révision 27).
Applications futurs ou s'y Après avoir maîtrisé cette technique
Le modèle OIH / de tolérance expérimentale, nous présentons ici peut être adapté de manière similaire à des souris génétiquement modifiées afin d'évaluer le rôle des gènes individuels dans la modulation de la douleur. Elle fournit également un système modèle pour étudier l'efficacité des agents thérapeutiques potentiels pour soulager la douleur chronique.
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions le Dr JL. Galzi (UMR7242 CNRS; Illkirch, France) pour son soutien.
Ce travail a été soutenu par le CNRS, l'INSERM, l'Université de Strasbourg, Alsace BioValley et par des subventions de Conectus, Agence Nationale de la Recherche (ANR 08 EBIO 014,02) Conseil Régional d'Alsace (Pharmadol), Communauté Urbaine de Strasbourg (Pharmadol), ICFRC (Pharmadol), OSEO (Pharmadol), la Direction Générale des Entreprises (Pharmadol).
Name | Company | Catalog Number | Comments/description |
C57BL/6N Tac mice | Taconic, Ry, Denmark | C57BL/6N Tac B6-M | Male mice (25-30g) |
Morphine hydrochloride | Francopia, Paris, France | CAS n° 52-26-6 | Delivered with special authorization |
Syringes (Terumo) | Dutscher, Brumath, France | 050000 | Polypropylene; Sterile; Volume : 1 ml |
Needles (Terumo) | Dutscher, Brumath, France | 050101 | G26 ½ (Terumo reference : NN2613RO1) |
Mouse restrainer | Home-made | – | Two metallic grids (5x11cm) assembled with adhesive tape and staples. |
Thermostated water bath GR150 | Grant Instruments, Cambridge, UK | GP 0540003 | |
Analgesimeter | Panlab, Barcelona, Spain | LE 7306 | |
Kaleidagraph software | Synergy software, Reading, PA, USA | Kaleidagraph 4.03 | Scientific graphing |
STATview software | Free download; Statistics |