Descriviamo un protocollo di esaminare lo sviluppo di iperalgesia indotta da oppioidi e tolleranza nei topi. Sulla base della misurazione di risposte nocicettive termica e meccanica di capre e morfina-trattata, consente di quantificare l'aumento della sensibilità al dolore (iperalgesia) e diminuire in analgesia (tolleranza) associati alla somministrazione cronica di oppiacei.
Iperalgesia indotta da oppioidi e tolleranza impatto gravemente l'efficacia clinica di oppiacei come antidolorifici negli animali e nell'uomo. I meccanismi molecolari alla base di entrambi i fenomeni non sono ben compresi e la loro spiegazione dovrebbero beneficiare dallo studio di modelli animali e per l'elaborazione di adeguati protocolli sperimentali.
Descriviamo qui un approccio metodologico per l'induzione, la registrazione e la quantificazione iperalgesia indotta dalla morfina, così come per mettere in evidenza la tolleranza analgesica, utilizzando i test di pressione coda immersione e di coda in topi wild-type. Come mostrato nel video, il protocollo è diviso in cinque fasi sequenziali. Fasi di movimentazione e assuefazione permettono una sicura determinazione della risposta nocicettiva basale degli animali. Somministrazione cronica di morfina induce significativa iperalgesia come dimostrato da un aumento sia della sensibilità termica e meccanica, mentre il confronto di analgesia temporali corsi dopo acuta o reptrattamento con morfina eated indica chiaramente lo sviluppo di tolleranza si manifesta con un calo di ampiezza risposta analgesica. Questo protocollo può essere adattato in modo simile a topi geneticamente modificati al fine di valutare il ruolo dei singoli geni nella modulazione della nocicezione e morfina analgesia. Esso fornisce anche un sistema modello per studiare l'efficacia di potenziali agenti terapeutici per migliorare l'efficacia analgesica oppiacei.
Indotta da oppioidi iperalgesia (OIH) e la tolleranza analgesico limitano l'efficacia clinica di oppiacei negli animali e nell'uomo 1-3. Il coinvolgimento delle pro-infiammatori 4,5 o di pro-nocicettivi (anti-oppioidi) 6,7 sistemi sono attualmente esplorate ipotesi. La delucidazione dei meccanismi alla base OIH e tolleranza richiede una combinazione di in vivo e in vitro approcci, utilizzando modelli animali appropriati, protocolli sperimentali e strumenti molecolari.
Farmacologia comportamentale è il paradigma dominante per monitorare e quantificare gli stati analgesici e iperalgesiche negli animali da laboratorio (ratti, topi). L'applicazione di uno stimolo nocivo (chimico termici, meccanici o) ad una parte del corpo comoda (zampa posteriore, coda) dell'animale porta ad un ritiro nocifensive che può essere facilmente ottenuto.
Proponiamo qui un approccio metodologico per l'induzione, la registrazione e la quantificazione OIH etolleranza in topi wild-type, utilizzando i test di pressione coda immersione e di coda. La procedura consente una determinazione semplice, sensibile e riproducibile dei valori di risposta nocicettiva termica e meccanica nei topi. Come dimostrato nel protocollo video, C57BL / 6 topi significativa esperienza iperalgesia dopo somministrazione cronica di morfina e mantenere questo per diversi giorni. Entrambi i valori nocicettivi termiche e meccaniche sono significativamente ridotti, rispetto a misurazioni di base sugli animali naïve. Inoltre, il set-up sperimentale permette di monitorare, in aggiunta allo sviluppo di OIH, il declino della risposta analgesica di morfina (tolleranza). Dati presentati supportano l'opinione che iperalgesia e la tolleranza possono comportare meccanismi cellulari e molecolari comuni 8,9, anche se questo è pacifico nella letteratura 1,10-12. Infine, questo protocollo può essere adattato in modo simile a topi geneticamente modificati al fine di valutare il ruolo dei singoli geni nella modulazionezione del dolore. Esso fornisce anche un sistema modello per valutare l'efficacia dei potenziali agenti terapeutici per migliorare effetti analgesici oppiacei.
Fasi critiche
Scelta del modello animale per misure nocicezione
La variabilità nella sensibilità nocicettiva e analgesico tra topi ceppi è stato esaminato (14-16) recensioni recensioni utilizzando diversi modelli di dolore differenti nella loro eziologia (nocicettivi, infiammatorio, neuropatico), modalità (termica, chimica, meccanica), la durata (acuta, tonico, cronica) e del sito di somministrazione (cutanea, sottocutanea, viscerale). Rispetto ad altri ceppi, C57BL/6J ("J" per Jackson Laboratory) topo è diventato un modello animale popolare per studi sul dolore in quanto presentano un elevato basale sensibilità nocicettiva 17,18 e una risposta analgesica moderata a oppiacei 14,19. Dopo il trattamento morfina cronico, ma anche sviluppare significativa tolleranza analgesica 20,21, iperalgesia 21,22 e dipendenza 20,23.
nt "> Qui, gli esperimenti sono stati condotti su topi C57BL/6N Tac (" N "per il National Institute of Health e" Tac 'per Taconics azienda) che appartengono a un ramo separato del lignaggio B6. Sebbene C57BL / 6 topi sono stati a lungo considerati intercambiabili, studi recenti hanno indicato significative differenze di comportamento dei C57BL/6J e C57BL/6N ceppi 24. In particolare, la minore sensibilità dei tre substrains C57BL/6N (compresa la Tac uno) per acuto dolore termico può essere considerato come un vantaggio per testare questo fenotipo.Topi maschi sono stati selezionati come la stragrande maggioranza degli studi di dolore, utilizzando topi come modello animale, eseguite sui maschi minorenni 25. Nelle nostre mani, hanno fornito dati affidabile e riproducibile, se esaminato da un analgesico o iperalgesia punti di vista. Occasionalmente, abbiamo notato una tendenza per le femmine C57BL/6N di fornire risposte più variabile, sia nel TIT e prove TPT. Anche se questa osservazione puòriflettere le variazioni naturali legati allo status ormonale delle femmine, meccanismi globali sottostanti differenze di sesso nel dolore e analgesia rimangono ancora oggetto di controversia. Alcuni aspetti di questo dibattito caldo saranno brevemente presentati nei prossimi "Limiti della tecnica 'sezione.
Assuefazione degli animali
I topi sono stati autorizzati prima di abituarsi alla struttura animale durante una settimana. Simile a qualsiasi altro studio comportamentale, misurazione è stata eseguita dopo un periodo di 3 giorni acclimatazione (Figura 1, fase A). Come test nocicettivi sono sensibili allo stress, primi provvedimenti possono dare latenze più lunghe di quelle successive, soprattutto nel topo non abituati 26,27. Il passo assuefazione consente anche l'ottenimento di valori di risposta nocicettivi più stabili nello stesso giorno e tra giorni Figure 2 e 4. Per ridurre gli effetti circadiani sulla nocicettivo e analgesicosensibilità 28,29, tutti i collaudi sono state condotte 10:00-04:00.
Selezione di test nocicettivi
Test nocicettivo utilizzano sia termica, meccanica, chimica o stimoli elettrici (revisione 26,27,30. La loro scelta è fondamentale in quanto diverse modalità nocicettivi possono essere trattati attraverso diversi nocicettori e fibre 18,31,32.
Abbiamo scelto la prova di coda di immersione (TIT) 33, una versione modificata del test coda flick classico sviluppato da D'amour e Smith 34, e la prova di pressione coda (TPT), adattato da Randall e Selitto 35, come esempi di termica e modalità di meccanici per studiare analgesia morfina-indotto, iperalgesia e la tolleranza nei topi. Entrambi i test sono stati ampiamente utilizzati nei ratti. Una volta tagliato è stato sistematicamente definito per evitare o limitare il rischio di danni ai tessuti.
Morphine-induzioneed analgesia, iperalgesia e tolleranza
La morfina, il prototipo mu-oppiaceo agonista, è stato scelto qui perché è un analgesico potente e OIH-induttore, sia negli esseri umani e nei topi 1,2,36. La morfina analgesico potenza è noto a variare con ceppi di topi, vie di somministrazione e modalità nocicettivi. In C57BL / 6 topi, analgesia affidabile è solitamente ottenuta dopo iniezioni sottocutanee di morfina nell'intervallo 1-20 dosaggio mg / kg 14,21. Di conseguenza, abbiamo scelto di studiare analgesia acuta a seguito di una singola somministrazione (sc) di morfina a 5 mg / kg, vicino al suo valore ED 50 (7-20 mg / kg), valutato da nocicezione termica 19,21.
Somministrazione di morfina ripetuta è spesso accompagnata con una tolleranza analgesica (attestata da uno spostamento verso destra della curva dose-risposta o da una diminuzione dell'ampiezza della risposta analgesica o durata) e iperalgesia (una sensibilità esacerbata a dolorose StimulHo evidenziato da una diminuzione del valore basale nocicettivo). Entrambi i fenomeni negativi dipendono ceppi di ratti, dalla natura del composto oppiacei che viene selezionato e il suo dosaggio, sulla durata del trattamento e sulle modalità nocicettivi 21. Ad esempio, paradigmi sperimentali per studiare la tolleranza e iperalgesia consistono nella somministrazione giornaliera di elevata e costante (da 20 a 40 mg / kg al giorno) 22 o di crescenti (fino a 50 o anche 200 mg / kg) 20,21 dosi di morfina. Di conseguenza, abbiamo promosso lo sviluppo di iperalgesia e tolleranza in topi C57BL / 6 tramite somministrazione di morfina al giorno (5 mg / kg; sc) per un periodo di 8 giorni. Questa dose di morfina moderata è stato preferito rispetto a quelli più elevati per un migliore utilizzo clinica mimica.
Imposta di finestra operativa TIT
Una possibile trappola in TIT potrebbe essere correlato al ruolo della coda nella termoregolazione di roditori 26,37. Quando la temperatura ambiente è un fattore chiave per nociceptive variazioni di risposta, essa deve essere mantenuta costante (qui a 21 ° C) durante esperimenti 38. Intensità di calore in genere costituito da rilevare una risposta nocicettiva entro 5 a 10 sec 27. Infatti, maggiori latenze possono aumentare il rischio per il controllo dei movimenti di animali non correlati allo stimolo nocicettivo, mentre quelle più corte possono ridurre la potenza differenziale del test. Abbiamo effettuato le misurazioni TIT ad una temperatura fissa di 48 ° C. Latenze ritiro Tail erano vicini a 9 sec (valore basale nocicettivo) e varia da 4 sec (iperalgesia) per 25 sec (analgesia massima, tagliare). Oltre a ragioni pratiche, misurazioni di valori di risposta nocicettivi ad una temperatura fissa possono a priori coinvolgere lo stesso repertorio di nocicettori e circuiti, facilitando così l'interpretazione dei dati.
Possibili modifiche
Ottimizzazione della finestra operativa TIT per l'analgesia e OIH MeasureMenti
Quando concentrandosi su una risposta analgesica, valori basali bassi (maggiore intensità di calore) possono favorire l'individuazione di un ritardo nella risposta. A sua volta, per affrontare la conseguenza di uno stimolo doloroso o lo sviluppo di OIH, elevati valori basali (intensità di calore più bassa; qui 48 ° C) può facilitare l'individuazione di risposte veloci Figura 4.
Anche se abbiamo trovato morfina a 5 mg / kg una dose conveniente per indurre una risposta analgesica robusta figura 3 e di promuovere (somministrazione ripetuta) iperalgesia significativa Figura 4, il suo dosaggio può essere adattato come accennato prima (fase critica: analgesia morfina, iperalgesia e tolleranza). Ad esempio, dosi inferiori possono essere utilizzati per ridurre analgesia ampiezza (evitando limitazioni cut-off) che dosi più elevate possono essere scelti per accelerare iperalgesia insorgenza e aumentare la sua ampiezza.
OveRall, ottimizzazione della 'finestra nocicettivo' deve essere adattata alla background genetico dei topi in fase di studio e prendere in considerazione la possibilità per il coinvolgimento di matrici distinte di nocicettori e circuiti.
Agonisti oppiacei alternativi (fentanil, remifentanyl)
Sebbene oppiacei utilizzati clinicamente più bersaglio il recettore mu-oppioide come agonisti, differiscono notevolmente per quanto riguarda le loro proprietà farmacologiche sia in vitro che in vivo. Ad esempio, remifentanyl e fentanyl, in netto contrasto con la morfina, si comportano come agonisti completi e promuovere internalizzazione dei mu-oppioidi recettori 39. Analgesici oppiacei come la morfina e fentanil hanno emivita nel range di 40 ore, mentre remifentanyl ha un ultra-breve emivita di diversi minuti 41. Negli esseri umani, miglior prova per OIH è da pazienti che hanno ricevuto oppiacei durante l'intervento, tra cui breve durata d'azione compounds come remifentanyl 2,42. Così, fentanil e remifentanyl possono essere preziosi strumenti troppo per studiare lo sviluppo di iperalgesia e della tolleranza nei topi, sotto TIT e paradigmi TPT.
Modi alternativi di induzione di OIH (cronica vs somministrazione acuta)
OIH è visto negli esseri umani e modelli animali a seguito di somministrazione di oppiacei, anche a livelli molto bassi o estremamente alti dosaggi 1,2. Riportiamo qui sullo sviluppo OIH dopo il trattamento cronico di topi con dosi moderate di morfina. Diversi giorni di trattamento dei topi C57BL/6N erano necessari per evidenziare una chiara e riproducibile iperalgesico Figura Stato iniezioni di morfina 4 giornaliere potrebbero essere adeguatamente sostituiti con pellet morfina impiantati:. Alla loro rimozione, sia iperalgesia termica e allodinia meccanica sono stati già segnalati nei topi 43. L'infusione di oppiacei attraverso una micro-pompa osmotica è un'altra possibilità 44. Nei roditori, iperalgesia duraturo è realizzabile anche dopo somministrazione acuta di fentanil usando un protocollo mimando l'uso di questo agonista mu-oppioide in chirurgia umana 36,45,46.
Limitazioni della Tecnica
Specie animali e modelli per il dolore
Studi comparativi di numerosi ceppi di topi fornito prove per grandi variazioni nelle risposte nocicettive a stimoli dolorosi 17,31,47 e nei livelli Oih a seguito di trattamento di 4 giorni morfina 22. Se i meccanismi alla base di elaborazione del dolore e modulazione in modelli animali (topi e ratti) sono rilevanti per i pazienti con dolore cronico rimane una domanda fondamentale e aperto. Quindi, molta cautela deve essere prestata l'interpretazione dei dati animali e alla loro validità predittiva per gli esseri umani 16.
Differenze di genere nel dolore e analgesia
S copi "> sono stati condotti maggior parte degli studi preclinici su modelli animali di dolore su roditori maschi 16,25,48. Nonostante questo bias di selezione, la vista emergente è stato quello di considerare i maschi come responder migliori ai analgesici oppiacei 49,50, meno incline a sviluppare oppioidi iperalgesia 51,52 e più tollerante alla morfina analgesia 53 rispetto alle loro controparti femminili (revisione 54)-indotta. Tuttavia, le differenze di sesso in materia di nocicezione ed efficacia farmaci analgesici non riprendono in tale 'un one size fits all' paradigma. Infatti, una ricchezza di dati indica ora che numerose variabili possono influenzare la grandezza e la direzione delle differenze di sesso, quali l'efficacia degli oppioidi droga e selettività, test nocicettivo, background genetico, l'età, lo stato gonado-ormonale o di interazione sociale 48,54. Negli esseri umani, il dolore clinico è più frequente nelle donne, ma se questo fatto rispecchia le reali differenze di sesso rimane una questione di dibattito 48,55,56. For esempio, l'analisi globale di cinquanta studi clinici ha indicato differenze significative nelle proprietà analgesiche tra i generi che meta-analisi eseguita su argomenti pazienti-controllati evidenziato una significativa maggiore efficacia degli oppioidi nelle donne 57. Quest'ultima osservazione, che contrasta nettamente con quello che è stato trovato in roditori, solleva di nuovo diverse domande riguardanti l'origine di tale divergenze 16,48,55,57. Complessivamente, esistono differenze di sesso in analgesia e merito ulteriormente concentrarsi sui meccanismi sottostanti e implicazioni cliniche.A proposito di test nocicettivo
Il test ritiro coda è un riflesso spinale, ma può essere soggetto a influenze sovraspinali 58. TIT è relativamente facile da eseguire su ratti ma richiede più competenze nei topi. Un potenziale difficoltà è di mantenere il mouse in una postura corretta senza indurre sollecitazioni indesiderate. Il protocollo proposto può essere regolata a secondadimensioni coorte. 16 animali (8 controllo e 8 trattati) sono facilmente gestibili per quanto riguarda la misurazione dei valori di risposta nocicettiva basali (utilizzando TIT prima, poi TPT per tutta la serie di topi) è sotto preoccupazione. Monitoraggio corsi a tempo analgesia richiede l'istituzione di un calendario preciso e la valutazione del numero massimo di animali che possono essere testati (TIT, poi TPT) entro l'intervallo di tempo impartita (qui 30 min). L'intero gruppo di animali può quindi essere diviso in sottogruppi per consentire lo sperimentatore di rispettare limitazioni cinetiche.
Importanza della Tecnica rispetto al / metodi alternativi esistenti
OIH nei ratti contro topo
I ratti sono stati ampiamente utilizzati per studiare l'analgesia con oppioidi, iperalgesia e tolleranza, a seguito acuta o cronica somministrazione di oppiacei 46,59-61. Infatti, per diversi motivi pratici, essi possono essere considerati miglioritopi come modello animale per esperimenti di dolore 16,61. Tuttavia, fino a poco tempo, la generazione di topi geneticamente modificati non è una procedura semplice. Come numerosi ceppi di topi geneticamente modificati sono già disponibili, il nostro modello offre l'opportunità di studiare il contributo di numerosi geni singoli OIH e sviluppo della tolleranza nei topi.
TIT e TPT contro altri test nocicettivi
TIT è una variante del test tail flick, la differenza più evidente è l'area di stimolazione. In contrasto con calore radiante, immersione della coda in acqua calda porta ad un aumento rapido e uniforme della sua temperatura. Rispetto ad altre forme di test nocicezione termica (test di hot-piastra o Hargreaves), TIT fornisce risultati abbastanza riproducibili sia attraverso e all'interno di soggetti.
TPT è un test molto popolare per lo studio della nocicezione meccanica 26,27,35 che coinvolge probabilmentefibre nocicettive distinti e trasduttori molecolari poi TIT 32. Esso fornisce misure veloci e affidabili 59, ma richiede una certa perizia da sperimentatore e grandi coorti di animali. In alternativa alla analgesimeter utilizzato nel presente studio, altre procedure o apparecchi basandosi su estensimetri esistono (rassegna 27). TPT è più adatto per studiare l'iperalgesia meccanica che filamenti di von Frey sono di solito prese per valutare allodinia meccanica (revisione 27).
Le applicazioni future o arrivarci Dopo aver imparato questa tecnica
Il modello sperimentale OIH / tolleranza presentiamo qui può essere adattato in modo simile a topi geneticamente modificati al fine di valutare il ruolo dei singoli geni nella modulazione del dolore. Fornisce inoltre un sistema modello per studiare l'efficacia di potenziali agenti terapeutici per alleviare il dolore cronico.
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo il Dr. JL. Galzi (UMR7242 CNRS, Illkirch, Francia) per il suo sostegno.
Questo lavoro è stato sostenuto dal CNRS, INSERM, Université de Strasbourg, Alsace BioValley e da sovvenzioni dal Conectus, Agence National de la Recherche (ANR 08 EBIO 014.02) Conseil Régional d'Alsace (Pharmadol), Communauté Urbaine de Strasbourg (Pharmadol), ICFRC (Pharmadol), OSEO (Pharmadol), Direction Générale des Entreprises (Pharmadol).
Name | Company | Catalog Number | Comments/description |
C57BL/6N Tac mice | Taconic, Ry, Denmark | C57BL/6N Tac B6-M | Male mice (25-30g) |
Morphine hydrochloride | Francopia, Paris, France | CAS n° 52-26-6 | Delivered with special authorization |
Syringes (Terumo) | Dutscher, Brumath, France | 050000 | Polypropylene; Sterile; Volume : 1 ml |
Needles (Terumo) | Dutscher, Brumath, France | 050101 | G26 ½ (Terumo reference : NN2613RO1) |
Mouse restrainer | Home-made | – | Two metallic grids (5x11cm) assembled with adhesive tape and staples. |
Thermostated water bath GR150 | Grant Instruments, Cambridge, UK | GP 0540003 | |
Analgesimeter | Panlab, Barcelona, Spain | LE 7306 | |
Kaleidagraph software | Synergy software, Reading, PA, USA | Kaleidagraph 4.03 | Scientific graphing |
STATview software | Free download; Statistics |