概要

Whole Cell Patch-Clamp für erforschen die Mechanismen der Infrarot Neural Stimulation

Published: July 31, 2013
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概要

Infrarot Nervenstimulation als Alternative, eine elektrische Stimulation in einem Bereich von Nerven-Typen, einschließlich derjenigen mit auditorischen System zugeordnet vorgeschlagen. Dieses Protokoll wird ein Patch-Clamp-Verfahren zur Untersuchung des Mechanismus der Infrarot Nervenstimulation in einer Kultur von primären auditorischen Nervenzellen.

Abstract

Es hat sich in den letzten Jahren gezeigt, dass gepulste Infrarot-Laserlicht verwendet werden, um elektrische Reaktionen in neuronalen Gewebe hervorzurufen, unabhängig von einer weiteren Abwandlung der Zielgewebe. Infrarot neuronale Stimulation in einer Vielzahl von peripheren und sensorischen neuronalen Gewebe wurde in vivo angegeben, wobei besonderes Interesse an der Stimulation der Nervenzellen im auditorischen Nervenzellen gezeigt. Während jedoch INS gezeigt wurde, dass in diesen Einstellungen funktionieren, ist der Mechanismus (oder Mechanismen), durch die Infrarot-Licht bewirkt neuronalen Erregung momentan nicht gut verstanden. Das Protokoll hier beschreibt eine ganze Zelle Patch-Clamp-Methode entwickelt, um die Untersuchung von Infrarot neuronale Stimulation in kultivierten primären auditorischen Neuronen zu erleichtern. Durch gründliches Charakterisierung der Reaktion dieser Zellen auf Infrarot-Laserbelichtung in vitro unter kontrollierten Bedingungen kann es möglich sein, ein verbessertes Verständnis der grundlegenden Physica gewinnenl und biochemischen Prozessen zugrunde liegenden neuronalen Infrarot-Stimulation.

Introduction

Die Felder der Neurophysiologie und medizinischen Bionik verlassen sich stark auf Techniken, die steuerbare elektrische Stimulation der Antworten in Nervengewebe zu ermöglichen. Während elektrische Stimulation bleibt der Goldstandard in der neuronalen Erregung, leidet es an einer Reihe von Nachteilen wie das Vorhandensein der Stimulation Artefakte bei der Aufzeichnung neuronalen Antworten und einen Mangel an Stimulation Spezifität aufgrund der Ausbreitung von Strom in das umliegende Gewebe ein.

Die letzten zwei Jahrzehnte haben die Entwicklung von optisch vermittelten Stimulation Techniken 2 zu sehen. Einige dieser Techniken ist eine Änderung des Zielgewebes, entweder durch Zugabe eines bestimmten Moleküls (zB Käfig Moleküle) 3 oder irgendeine Form der genetischen Manipulation (z. B. optogenetics) 4, die beide nicht leicht außerhalb eines Forschungssetting gelten. Von besonderem Interesse ist daher Infrarot Nervenstimulation (INS), whereby Nervengewebe durch gepulste Infrarot-Laserlicht angeregt. INS hat das Potenzial, viele der Mängel der elektrischen Stimulation, indem du hochspezifische, berührungslose Stimulation von Nervengewebe 2 überwinden. Während jedoch INS wurde erfolgreich in einer Vielzahl von Einstellungen in vivo gezeigt, bleibt der genaue Mechanismus der Anregung unsicher.

Einige neuere Veröffentlichungen haben Fortschritte bei der Aufdeckung der Mechanismus hinter INS 5-7 gezeigt. Schnelle Erwärmung durch Absorption des Laserlichts durch Wasser scheint eine wichtige Rolle zu spielen. Doch jenseits dieser Konsens ist noch nicht erreicht. Shapiro et al. 7 schlagen eine sehr allgemeine Mechanismus, durch schnelle Erwärmung verursacht eine Störung in der Verteilung der geladenen Partikel angrenzend an die Zellmembran, was zu einer Änderung der Kapazität der Zellmembran und nachfolgende Depolarisation. Darüber hinaus Albert et al. 5 behaupten, dass laser induzierte Erwärmung aktiviert eine spezifische Klasse von temperaturempfindlichen Ionenkanälen (transient receptor potential vanilloid Kanäle), so dass Ionen durch die Zellmembran passieren. Zu diesem Zeitpunkt ist es unklar, wie diese Mechanismen zu kombinieren, oder auch, ob es weitere Faktoren, die noch identifiziert werden.

Obwohl eine kleine Anzahl von Publikationen (Referenzen 5,7-9) INS in vitro untersucht haben, hat sich die überwiegende Mehrheit der Arbeiten in diesem Bereich veröffentlicht wurden in vivo durchgeführt (zB Referenzen 1,6,10-18). Infrarot Stimulation der akustischen Neuronen hat eine Fläche von besonderem Interesse, wegen der möglichen Anwendungen in Cochlea-Implantaten 10,14-18. Während in vivo Experimente sind wichtig, um die Wirksamkeit der Technik in verschiedenen Einstellungen, die erhöhte Maß an Kontrolle gewährt durch in-vitro-Studien wird erwartet, dass eine genauere Verständnis der mech führen überprüfenmus verantwortlich für INS. Dieser Bericht beschreibt die Herstellung von kultivierten Neuronen Spiralganglienzellen für Patch-Clamp-Untersuchungen, da diese verwendet werden, um grundlegende Mechanismen zu studieren, während auch die Verknüpfung der großen Körper der vorhandenen Daten aus dem auditorischen System werden.

Die Patch-Clamp-Technik ist ein ausgezeichnetes Werkzeug für die Untersuchung von elektrophysiologischen Phänomene, ein Mittel zur Aufzeichnung der elektrischen Aktivität in einzelnen Zellen und der Untersuchung der Beteiligung der einzelnen zugrunde liegenden Strömungen 19. Wenn diese Technik zu einer stabilen in vitro Herstellung von primären Neuronen, wie kultivierten Neuronen Spiralganglienzellen angewendet, bietet es die Möglichkeit, in die Tiefe, durch welche Mechanismen neuronaler Aktivität gesteuert und manipuliert wird, zu studieren.

Die Protokolle in dieser Arbeit Umriss Methoden zur Untersuchung der Wirkung von Laser-Stimulation auf die elektrischen Eigenschaften der Spirale Ganglionneuronen angegeben durch Patch-Clamp-Aufnahmen. Der Ansatz basiert auf einer Faser-gekoppelte Laser anstelle eines Freiraum-Laser basiert, ermöglicht einen sicheren Betrieb sowie einfacher und wiederholbare Ausrichtung ohne die Notwendigkeit, die Standard-Mikroskop-Konfiguration ändern. Auf der Grundlage dieser Protokolle, sollte es möglich sein, eine breite Palette von Experimenten durchzuführen, um mehr eindeutig zu bestimmen, den Mechanismus oder Mechanismen INS.

Protocol

1. Kultur von Spiral Ganglionneuronen Sterilisieren kleinen runden (z. B. 10 mm Durchmesser) Deckgläschen und gebogenen Pinzette in einem Autoklaven. Übertragen Sie die sterilisierten Deckgläschen in einzelne Vertiefungen einer sterilen 4-Ring 35 mm Petrischale oder 4-Well-Platte mit den sterilisierten Pinzette. Bewerben 150 ul von Poly-L-Ornithin (500 ug / ml) und Mauslaminin (0,01 mg / ml) auf die Oberseite des Deckglases und in einen Inkubator (37 ° C) für bis zu 48 Stunden. Stellen Sie siche…

Representative Results

Spiral Ganglionneuronen auf Laserbeleuchtung reagieren mit wiederholbaren Wellenformen sowohl Voltage-Clamp-und Strom-Clamp-Aufnahme-Konfigurationen. 3a zeigt typische Änderungen des Stromflusses durch eine Zellmembran in Antwort auf eine 2,5 ms, 0,8 mJ Laserpuls (durchschnittliche Reaktionszeit von 6 Laserpulse, bei 1 sec Intervallen) mit dem Membranpotential bei -70 mV, -60 mV und -50 mV gehalten wiederholt. Net Einwärtsströme konsequent in Reaktion auf Laserpulse hervorgerufen, Rückkehr zu Ausgan…

Discussion

Mit den Protokollen vorliegenden Ausführungen ist es möglich, zu extrahieren und Kultur Spiralganglienzellen Neuronen und Laser-evozierte elektrische Aktivität durch Ausführen Ganzzell Patch-Clamp-Experimenten untersucht. Bei in vitro verwendet werden, bietet der Patch-Clamp-Verfahren eine Stufe der Kontrolle über die experimentellen Parameter, die nicht in vivo zu erreichen ist. Laser Stimulationsparameter wie Wellenlänge, Pulsenergie, Pulslänge, Pulsform und Impulsfolgefrequenz Sequenzen könn…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde vom Australian Research Council unter Linkage Projektstipendium LP120100264 unterstützt.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number コメント
Cell culture materials and equipment
Glass coverslips Lomb Scientific CSC 10 1 GP
4-ring cell culture dish VWR International 82050-542
Poly-L-ornithine solution Sigma-Aldrich P4957
Laminin Invitrogen 23017-015
Curved forceps WPI 14101 Dumont #5 tweezers (45° angle tip)
CO2 Incubator ThermoScientific Heracell 150i
Table 1. Cell culture materials and equipment.
Neurobasal media
Neurobasal A Gibco 10888-022
N-2 supplement Invitrogen 17502-048
B27 serum-free supplement Invitrogen 17504-044
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140-148
L-Glutamine Invitrogen 25030-149
Intracellular solution
Potassium chloride Sigma-Aldrich P4504
HEPES Sigma-Aldrich H4034
Potassium D-gluconate Sigma-Aldrich G4500
EGTA Sigma-Aldrich E3889
Na2ATP Sigma-Aldrich A2383
MgATP Sigma-Aldrich A9187
NaGTP Sigma-Aldrich G8877
Potassium hydroxide LabServ BSPPL738.500
Sucrose Sigma-Aldrich S8501
Extracellular solution
Sodium chloride Sigma-Aldrich 310166
Potassium chloride Sigma-Aldrich P4504
HEPES Sigma-Aldrich H4034
Calcium chloride Sigma-Aldrich 383147
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M8266
D-Glucose Sigma-Aldrich G8270
Sodium hydroxide LabServ BSPSL740.500
Sucrose Sigma-Aldrich S8501
Table 2. Solutions for cell culture and patch clamp. a) Neurobasal media. b) Intracellular solution. c) Extracellular solution.
Upright microscope Zeiss AxioExaminerD1 Equipped with Dodt contrast
Water-immersion objective Zeiss W Plan-APOCHROMAT 40x/0.75
Platform and X-Y stage ThorLabs Burleigh Gibraltar
Recording chamber Warner Instruments RC-26G
Vibration isolation table TMC Micro-g 63-532
CCD Camera Diagnostic Instruments RT1200
Camera software Diagnostic Instruments SPOT Basic
In-line solution heater Warner SH-27B
Temperature controller Warner TC-324B
Patch clamp amplifier Molecular Devices Multiclamp 700B
Patch clamp data acquisition system Molecular Devices Digidata 1440A
Micromanipulator Sutter Instruments MPC-325
Micropipette glass Sutter Instruments GBF100-58-15 Borosilicate glass with filament
Micropipette Puller Sutter Instruments P2000
Recording Software AxoGraph Lab pack and electrophysiology tools
Aspirator bottle Sigma-Aldrich CLS12201L 1 L Pyrex aspirator bottle, with outlet for tubing
PE Tubing Harvard PolyE #340
Masterflex peristaltic pump Cole-Parmer HV-07554-85
Table 3.Patch clamp equipment.
1,870 nm laser diode Optotech
200/220 μm diameter multimode optical fiber patch cord (FC/PC) AFW Technologies MM1-FC2-200/220-5-C-0.22 Light delivery optical fiber, silica core and cladding, 0.22 NA
Optical fiber through connector (FC/PC) Thorlabs ADAFC2
Optical fiber cleaver EREM FO1
Optical fiber stripping tool (0.25 – 0.6 mm) Siemens For removing optical fiber jacket
Optical fiber stripping tool (0.6 – 1.0 mm) Siemens For removing outer coating of patch cord
Signal generator Any signal generator that can output the necessary pulse shapes and is capable of being externally triggered
Optical fiber positioner Custom made positioner. Could substitute with standard micropositioner used for patch clamp experiments
Optical fiber chuck Newport FPH-DJ
Laser power meter and detector head Coherent FieldMate (power meter) with LM-3 (detector head)
Table 4. Laser equipment.

参考文献

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記事を引用
Brown, W. G. A., Needham, K., Nayagam, B. A., Stoddart, P. R. Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation. J. Vis. Exp. (77), e50444, doi:10.3791/50444 (2013).

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