概要

Whole Cell Patch Clamp voor Onderzoek naar de mechanismen van Infrarood Neural Stimulatie

Published: July 31, 2013
doi:

概要

Infrarood zenuwstimulatie is voorgesteld als een alternatief voor elektrische stimulatie in een reeks zenuw types, waaronder die gepaard gaan met het gehoorsysteem. Dit protocol beschrijft een patch clamp methode voor het bestuderen van het mechanisme van infrarood zenuwstimulatie in een kweek van primaire auditieve neuronen.

Abstract

Aangetoond is de laatste jaren dat gepulste, infrarood laserlicht kan worden gebruikt om elektrische reacties uitlokken in neuraal weefsel, onafhankelijk van de verdere modificatie van het doelweefsel. Infrarood zenuwstimulatie gerapporteerd in een verscheidenheid van perifere sensorische en neuraal weefsel in vivo, met weergegeven in stimulatie van neuronen in de gehoorzenuw bijzonder belang. Echter, terwijl de INS is aangetoond dat het werken in deze instellingen, het mechanisme (of mechanismen) waardoor infrarood licht veroorzaakt neurale excitatie is op dit moment niet goed begrepen. Het protocol hier gepresenteerde beschrijft een hele cel patch clamp methode ontwikkeld om het onderzoek van de infrarode neurale stimulatie in gekweekte primaire auditieve neuronen vergemakkelijken. Door grondig karakteriseren van de respons van deze cellen infrarode laser belichting in vitro onder gecontroleerde omstandigheden, kan het mogelijk zijn om een beter begrip van de fundamentele Physica krijgenl en biochemische processen die ten grondslag liggen infrarode neurale stimulatie.

Introduction

De velden van de neurofysiologie en de medische bionica sterk afhankelijk van technieken die regelbare stimulatie van elektrische reacties in zenuwweefsel kunnen. Terwijl elektrische stimulatie blijft de gouden standaard zenuwopwekplaatsen, lijdt aan een aantal nadelen, zoals de aanwezigheid van stimulatie artefacten bij het ​​opnemen neurale respons, en een gebrek aan stimulatie specificiteit door de verspreiding van stroom in omringende weefsel 1.

De laatste twee decennia hebben de ontwikkeling van optisch gemedieerde stimulatie technieken 2 gezien. Een aantal van deze technieken vereisen aanpassing van het doelweefsel, via de toevoeging van een bepaald molecuul (bijv. gekooide moleculen) 3 of enige vorm van genetische manipulatie (bijv. optogenetics) 4, die geen van beide gemakkelijk buiten onderzoeksverband te passen. Van bijzonder belang is dan ook infrarood neurale stimulatie (INS), whereby zenuwweefsel wordt opgewekt door gepulseerd infrarood laserlicht. INS heeft de potentie om veel van de tekortkomingen van elektrische stimulatie overwinnen doordat zeer specifieke, contactloze stimulatie van zenuwweefsel 2. Hoewel INS met succes aangetoond in diverse instellingen in vivo, het precieze mechanisme van excitatie blijft onzeker.

Enkele recente publicaties hebben aangetoond vooruitgang naar het blootleggen van het mechanisme achter INS 5-7. Snelle verwarming als gevolg van absorptie van het laserlicht door het water lijkt een belangrijke rol te spelen. Daarnaast echter een consensus nog worden bewerkstelligd. Shapiro et al.. 7 stellen een zeer algemeen mechanisme waarmee snel verwarmen veroorzaakt een verstoring in de verdeling van geladen deeltjes naast de celmembraan, wat leidt tot een verandering in de capaciteit van de celmembraan en daaropvolgende depolarisatie. Bovendien Albert et al.. 5 beweren dat laser geïnduceerde verwarming activeert een specifieke klasse van temperatuurgevoelige ionkanalen (transient receptor potential vanilloid kanalen), waardoor ionen om door het celmembraan. In dit stadium is het onduidelijk hoe deze mechanismen te combineren, of zelfs of er andere factoren die nog moeten worden geïdentificeerd.

Hoewel een klein aantal publicaties (referenties 5,7-9) INS hebben in vitro onderzocht, heeft de overgrote meerderheid van het werk gepubliceerd op dit gebied is uitgevoerd in vivo (bv. referenties 1,6,10-18). Infrarode stimulatie van de auditieve neuronen is een gebied van bijzonder belang, gezien de potentiële toepassingen in cochleaire implantaten 10,14-18. Terwijl in vivo experimenten zijn belangrijk voor de effectiviteit van de techniek in verschillende instellingen, over de toegenomen geboden door in vitro studies controle naar verwachting leiden tot een meer gedetailleerd begrip van de mech controlerennisme verantwoordelijk voor de INS. Dit rapport beschrijft de bereiding van gekweekte ganglion spirale neuronen voor patch clamp onderzoeken, omdat deze kunnen worden gebruikt om fundamentele mechanismen bestuderen tegelijkertijd verbinden met de grote hoeveelheid bestaande gegevens uit het gehoorsysteem.

De patch clamp techniek is een uitstekend hulpmiddel voor het onderzoeken van elektrofysiologische fenomenen, een middel van het opnemen van elektrische activiteit in enkele cellen en het bestuderen van de bijdrage van de individuele onderliggende stromingen 19. Wanneer deze techniek wordt toegepast op een stabiele in vitro bereiding van primaire neuronen, zoals gekweekte ganglion spirale neuronen, biedt de mogelijkheid te bestuderen in de mechanismen waardoor neurale activiteit wordt gecontroleerd en gemanipuleerd diepte.

De in dit werk schema onderzoeken van het effect van laserstimulatie op de elektrische eigenschappen van de ganglion spirale neuronen door patch clamp protocollenopnames. De benadering is gebaseerd op een vezel-gekoppelde laser in plaats van een vrije ruimte laser, waardoor veiliger werken en gemakkelijker en herhaalbare uitlijning zonder de standaard microscoop configuratie te wijzigen. Op grond van deze protocollen, moet het mogelijk zijn een groot aantal experimenten om meer duidelijk het mechanisme of mechanismen achter INS.

Protocol

1. Cultuur van Spiral ganglionneuronen Steriliseren kleine ronde (bv. 10 mm diameter) dekglaasjes en gebogen pincet in een autoclaaf. Breng de gesteriliseerde dekglaasjes in afzonderlijke putjes van een steriele 4-ring 35 mm petrischaaltje of 4-well plaat, met behulp van de gesteriliseerde tang. Breng 150 pi van poly-L-ornithine (500 ug / ml) en muis laminine (0,01 mg / ml) op het bovenoppervlak van het dekglaasje en in een incubator (37 ° C) gedurende 48 uur. Zorg ervoor dat de dekglaasjes niet weg…

Representative Results

Ganglion spirale neuronen reageren op laser belichting met herhaalbare golfvormen in het voltage-clamp en stroom-clamp opname configuraties. Figuur 3a toont typische veranderingen in stroom over een celmembraan in respons op een 2,5 msec, 0,8 mJ laserpuls (gemiddelde reactietijd van 6 laserpulsen herhaald met intervallen van 1 seconde) met de membraanpotentiaal gehouden op -70 mV, -60 mV en -50 mV. Net naar binnen stromen worden consequent opgeroepen als reactie op laserpulsen, terug te keren naar de in…

Discussion

Met behulp van de in deze paper protocollen is het mogelijk om uit te pakken en cultuur spiraal ganglion neuronen en laser-opgewekte elektrische activiteit te onderzoeken door hele cellen patch clamp experimenten uitvoeren. Bij gebruik in vitro, de patch clamp techniek geeft een mate van controle over de experimentele parameters die niet haalbaar in vivo. Laserstimulatie parameters zoals golflengte, pulsenergie, pulslengte, pulsvorm, en pulsherhalingsfrequentie sequenties kunnen worden onderzocht in ee…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door de Australische Raad voor Onderzoek onder Linkage Project subsidie ​​LP120100264.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number コメント
Cell culture materials and equipment
Glass coverslips Lomb Scientific CSC 10 1 GP
4-ring cell culture dish VWR International 82050-542
Poly-L-ornithine solution Sigma-Aldrich P4957
Laminin Invitrogen 23017-015
Curved forceps WPI 14101 Dumont #5 tweezers (45° angle tip)
CO2 Incubator ThermoScientific Heracell 150i
Table 1. Cell culture materials and equipment.
Neurobasal media
Neurobasal A Gibco 10888-022
N-2 supplement Invitrogen 17502-048
B27 serum-free supplement Invitrogen 17504-044
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140-148
L-Glutamine Invitrogen 25030-149
Intracellular solution
Potassium chloride Sigma-Aldrich P4504
HEPES Sigma-Aldrich H4034
Potassium D-gluconate Sigma-Aldrich G4500
EGTA Sigma-Aldrich E3889
Na2ATP Sigma-Aldrich A2383
MgATP Sigma-Aldrich A9187
NaGTP Sigma-Aldrich G8877
Potassium hydroxide LabServ BSPPL738.500
Sucrose Sigma-Aldrich S8501
Extracellular solution
Sodium chloride Sigma-Aldrich 310166
Potassium chloride Sigma-Aldrich P4504
HEPES Sigma-Aldrich H4034
Calcium chloride Sigma-Aldrich 383147
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M8266
D-Glucose Sigma-Aldrich G8270
Sodium hydroxide LabServ BSPSL740.500
Sucrose Sigma-Aldrich S8501
Table 2. Solutions for cell culture and patch clamp. a) Neurobasal media. b) Intracellular solution. c) Extracellular solution.
Upright microscope Zeiss AxioExaminerD1 Equipped with Dodt contrast
Water-immersion objective Zeiss W Plan-APOCHROMAT 40x/0.75
Platform and X-Y stage ThorLabs Burleigh Gibraltar
Recording chamber Warner Instruments RC-26G
Vibration isolation table TMC Micro-g 63-532
CCD Camera Diagnostic Instruments RT1200
Camera software Diagnostic Instruments SPOT Basic
In-line solution heater Warner SH-27B
Temperature controller Warner TC-324B
Patch clamp amplifier Molecular Devices Multiclamp 700B
Patch clamp data acquisition system Molecular Devices Digidata 1440A
Micromanipulator Sutter Instruments MPC-325
Micropipette glass Sutter Instruments GBF100-58-15 Borosilicate glass with filament
Micropipette Puller Sutter Instruments P2000
Recording Software AxoGraph Lab pack and electrophysiology tools
Aspirator bottle Sigma-Aldrich CLS12201L 1 L Pyrex aspirator bottle, with outlet for tubing
PE Tubing Harvard PolyE #340
Masterflex peristaltic pump Cole-Parmer HV-07554-85
Table 3.Patch clamp equipment.
1,870 nm laser diode Optotech
200/220 μm diameter multimode optical fiber patch cord (FC/PC) AFW Technologies MM1-FC2-200/220-5-C-0.22 Light delivery optical fiber, silica core and cladding, 0.22 NA
Optical fiber through connector (FC/PC) Thorlabs ADAFC2
Optical fiber cleaver EREM FO1
Optical fiber stripping tool (0.25 – 0.6 mm) Siemens For removing optical fiber jacket
Optical fiber stripping tool (0.6 – 1.0 mm) Siemens For removing outer coating of patch cord
Signal generator Any signal generator that can output the necessary pulse shapes and is capable of being externally triggered
Optical fiber positioner Custom made positioner. Could substitute with standard micropositioner used for patch clamp experiments
Optical fiber chuck Newport FPH-DJ
Laser power meter and detector head Coherent FieldMate (power meter) with LM-3 (detector head)
Table 4. Laser equipment.

参考文献

  1. Wells, J., Kao, C., Jansen, E. D., Konrad, P., Mahadevan-Jansen, A. Application of infrared light for in vivo neural stimulation. Journal of Biomedical Optics. 10, 064003 (2005).
  2. Richter, C. P., Matic, A. I., Wells, J. D., Jansen, E. D., Walsh, J. T. Neural stimulation with optical radiation. Laser & Photonics Reviews. 5, 68-80 (2011).
  3. Kramer, R. H., Fortin, D. L., Trauner, D. New photochemical tools for controlling neuronal activity. Current Opinion in Neurobiology. 19, 544-552 (2009).
  4. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
  5. Albert, E. S., et al. Trpv4 channels mediate the infrared laser-evoked response in sensory neurons. Journal of Neurophysiology. 107, 3227-3234 (2012).
  6. Wells, J., et al. Biophysical mechanisms of transient optical stimulation of peripheral nerve. Biophysical Journal. 93, 2567-2580 (2007).
  7. Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. -. P., Bezanilla, F. Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance. Nature Communications. 3, 736 (2012).
  8. Bec, J. -. M., et al. Characteristics of laser stimulation by near infrared pulses of retinal and vestibular primary neurons. Lasers in Surgery and Medicine. 44, 736-745 (2012).
  9. Dittami, G. M., Rajguru, S. M., Lasher, R. A., Hitchcock, R. W., Rabbitt, R. D. Intracellular calcium transients evoked by pulsed infrared radiation in neonatal cardiomyocytes. Journal of Physiology (London). 589, 1295-1306 (2011).
  10. Izzo, A. D., et al. Laser stimulation of auditory neurons: Effect of shorter pulse duration and penetration depth. Biophysical Journal. 94, 3159-3166 (2008).
  11. Wells, J., Konrad, P., Kao, C., Jansen, E. D., Mahadevan-Jansen, A. Pulsed laser versus electrical energy for peripheral nerve stimulation. Journal of Neuroscience Methods. 163, 326-337 (2007).
  12. Teudt, I. U., Nevel, A. E., Izzo, A. D., Walsh, J. T., Richter, C. P. Optical stimulation of the facial nerve: A new monitoring technique. Laryngoscope. 117, 1641-1647 (2007).
  13. Jenkins, M. W., et al. Optical pacing of the embryonic heart. Nature Photonics. 4, 623-626 (2010).
  14. Izzo, A. D., Richter, C. P., Jansen, E. D., Walsh, J. T. Laser stimulation of the auditory nerve. Lasers in Surgery and Medicine. 38, 745-753 (2006).
  15. Izzo, A. D., et al. Selectivity of neural stimulation in the auditory system: A comparison of optic and electric stimuli. J. Biomed. Opt. 12, 021008 (2007).
  16. Richter, C. P., et al. Optical stimulation of auditory neurons: Effects of acute and chronic deafening. Hearing Research. 242, 42-51 (2008).
  17. Littlefield, P. D., Vujanovic, I., Mundi, J., Matic, A. I., Richter, C. P. Laser stimulation of single auditory nerve fibers. Laryngoscope. 120, 2071-2082 (2010).
  18. Izzo, A. D., et al. Optical parameter variability in laser nerve stimulation: A study of pulse duration, repetition rate, and wavelength. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 54, 1108-1114 (2007).
  19. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable-membranes. Annual Review of Physiology. 46, 455-472 (1984).
  20. Needham, K., Nayagam, B. A., Minter, R. L., O’Leary, S. J. Combined application of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 and its impact on spiral ganglion neuron firing properties and hyperpolarization-activated currents. Hearing Research. 291, 1-14 (2012).
  21. Coleman, B., Fallon, J. B., Pettingill, L. N., de Silva, M. G., Shepherd, R. K. Auditory hair cell explant co-cultures promote the differentiation of stem cells into bipolar neurons. Experimental Cell Research. 313, 232-243 (2007).
  22. Whitlon, D. S., et al. Survival and morphology of auditory neurons in dissociated cultures of newborn mouse spiral ganglion. 神経科学. 138, 653-662 (1016).
  23. Vieira, M., Christensen, B. L., Wheeler, B. C., Feng, A. S., Kollmar, R. Survival and stimulation of neurite outgrowth in a serum-free culture of spiral ganglion neurons from adult mice. Hearing Research. 230, 17-23 (2007).
  24. Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. B. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of corti. J. Vis. Exp. (36), e1685 (2010).
  25. Thompson, A. C., Wade, S. A., Brown, W. G. A., Stoddart, P. R. Modeling of light absorption in tissue during infrared neural stimulation. Journal of Biomedical Optics. 17, 075002 (2012).
  26. Snyder, A. W., Love, J. D. . Optical Waveguide Theory. , (1983).
  27. Thompson, A. C., Wade, S. A., Cadusch, P. J., Brown, W. G. A., Stoddart, P. R. Modelling of the temporal effects of heating during infrared neural stimulation. J. Biomed. Opt. 18, 035004-0310 (2013).
  28. Yao, J., Liu, B. Y., Qin, F. Rapid temperature jump by infrared diode laser irradiation for patch-clamp studies. Biophysical Journal. 96, 3611-3619 (2009).

Play Video

記事を引用
Brown, W. G. A., Needham, K., Nayagam, B. A., Stoddart, P. R. Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation. J. Vis. Exp. (77), e50444, doi:10.3791/50444 (2013).

View Video