Diffuse la tomographie par fluorescence offre une approche relativement peu coûteux et potentiellement à haut tout au long de préclinique<em> In vivo</emImagerie> tumeur. La méthodologie de la collecte de données optiques, d'étalonnage et de reconstruction d'image est présentée pour une tomodensitométrie-guidée sans contact dans le domaine temporel à l'aide du système de ciblage fluorescente du biomarqueur récepteur épidermique de facteur de croissance tumorale dans un modèle de gliome de la souris.
Petit animal de fluorescence imagerie moléculaire (FMI) peut être un outil puissant pour la découverte de médicaments précliniques et des études de développement 1. Cependant, l'absorption de lumière par les chromophores tissu (par exemple, l'hémoglobine, l'eau, les lipides, la mélanine) limite généralement de propagation de signal optique à travers des épaisseurs plus grandes que quelques millimètres 2. Comparé à d'autres longueurs d'onde visibles, l'absorption des tissus pour le rouge et le proche infrarouge (IR proche) absorption de la lumière diminue de façon spectaculaire et non-diffusion élastique devient le mécanisme d'interaction dominante lumière des tissus. Le développement relativement récent des agents fluorescents qui absorbent et émettent de la lumière dans le proche-IR (600-1000 nm), a entraîné le développement de systèmes d'imagerie et des modèles de propagation de lumière qui peut atteindre tout le corps en trois dimensions d'imagerie du petit animal 3.
Malgré de grands progrès dans ce domaine, la nature mal posé de la tomographie par fluorescence diffuse reste un importantproblème pour la stabilité, la récupération de contraste et la résolution spatiale des techniques de reconstruction d'image et de l'approche optimale pour l'IGF chez les petits animaux doit encore être convenue. La majorité des groupes de recherche ont investi en charge-coupled device (CCD) à base de systèmes qui fournissent en abondance la sensibilité des tissus-échantillonnage, mais sous-optimale 4-9, tandis que notre groupe et quelques autres ont poursuivi 10-13 systèmes basés sur les détecteurs de très haute sensibilité , qui à cette époque permettre l'échantillonnage des tissus denses pour être atteint qu'au prix d'un débit d'imagerie à faible. Ici, nous démontrons la méthodologie pour l'application de la technologie de détection de photon unique dans un système de tomographie de fluorescence pour localiser une lésion cancéreuse au cerveau dans un modèle murin.
La fluorescence de positons (FT) système employé comptage de photons uniques utilisant des tubes photomultiplicateurs (PMT) et riche en informations de détection de lumière dans le domaine temporel dans une conformation non-contact 11. Cela fournit un col simultanéelection de l'excitation transmise et l'émission de lumière, et comprend de contrôle automatique de l'exposition d'excitation de fluorescence 14, référencement laser, et co-inscription auprès d'un petit animal calculé la tomographie (microCT) système 15. Un modèle de souris nude a été utilisé pour l'imagerie. L'animal a été inoculé orthotopique avec une lignée cellulaire de gliome humain (U251) dans l'hémisphère cérébral gauche et imagée 2 semaines plus tard. La tumeur a été faite à la fluorescence par injection d'un traceur fluorescent, IRDye 800CW-EGF (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) ciblés sur des récepteurs du facteur de croissance épidermique, une protéine de membrane cellulaire connue pour être surexprimé dans la ligne U251 tumeur et de nombreux autres cancers 18. Une seconde, non ciblée traceur fluorescent, Alexa Fluor 647 (Life Technologies, Grand Island, NY) a également été injecté pour tenir compte des effets induits non-récepteurs sur l'absorption des traceurs ciblés pour fournir un moyen de quantifier liaison traceur et le récepteur de disponibilité / densité 27. Un CT-guidée, time-domaine algorithme a été utilisé pour reconstruire l'emplacement des deux traceurs fluorescents (c.-à-la localisation de la tumeur) dans le cerveau de souris et de leur capacité à localiser la tumeur a été vérifiée par contraste amélioré l'imagerie par résonance magnétique.
Bien en évidence pour l'imagerie de fluorescence dans un modèle murin de gliome, la méthodologie présentée dans cette vidéo peut être étendue à différents modèles de tumeurs dans divers modèles animaux de petite taille potentiellement jusqu'à la taille d'un rat 17.
Fluorescence tomographie (FT) est une question sensible, les rayonnements ionisants sans modalité d'imagerie moléculaire basée sur le transport de la lumière visible et le proche infrarouge à travers le tissu biologique. La plupart de l'intérêt de FT a été porté sur son potentiel afin d'accélérer la découverte de médicaments et le développement dans de petits animaux modèles expérimentaux 1 et une région clé de la recherche a été l'étude de l'expression des biomarqueurs du cancer et la réponse aux thérapies moléculaires 26. À l'heure actuelle, il existe deux approches concurrentes à la conception du système FT. La conception la plus courante est basée sur refroidis Charge-Coupled Device (CCD) pour la détection par fluorescence 4-9. Ce motif fournit une haute densité de mesures, pour prélever des tissus depuis maximiser chaque pixel dans la caméra CCD peut détecter la lumière qui a parcouru un trajet unique à travers le tissu. Cependant, les caméras CCD ont une gamme dynamique limitée et la lecture de bruit limite leur sensibilité ultime. La deuxième conception évite le potentiel limitation tions de détection caméra CCD en employant la technologie de comptage très sensible à photon unique sur la base de l'utilisation de détecteurs de tels que des tubes photomultiplicateurs ou des photodiodes à avalanche 10-13. L'inconvénient de ces méthodes de détection plus sensibles, c'est que chaque détecteur ne peut recueillir la lumière en un point unique, par conséquent, parvenir à un échantillonnage des tissus denses, soit de nombreux détecteurs doivent être utilisés (ce qui est très cher), ou de nombreuses projections doivent être imagé avec le même détecteur (qui peut prendre beaucoup de temps). Alors que le niveau optimal de prélèvement de tissu pour FT petit animal n'a pas été convenu, et peuvent varier au cas par cas, il est convenu que l'instrumentation de comptage de photon unique est mieux adaptée à explorer les limites de sensibilité de FT en termes de sa capacité à détecter de faibles concentrations de marqueurs moléculaires. Dans cette étude, nous fournissons une méthodologie pour la réalisation de FT en utilisant un seul photon instruments de détection de comptage pour localiser des tumeurs chez la souris.
ent "> Il ya quatre étapes essentielles pour produire des ensembles de données impliqués robustes avec le temps-corrélée à photon unique FT comptage. La première est l'application d'une procédure de calibrage approprié et simple. Dans la méthodologie présentée, les sensibilités respectives de chaque canal de détection sont comptabilisés par la collecte de mesures de référence de la lumière d'excitation transmis par le biais d'une ligne-diffuseur destiné à diriger des fractions égales de lumière à chaque détecteur 15. outre, la lumière détectée au cours d'une expérience en continu calibré pour l'laser de référence, en termes de l'intensité et la moyenne . temps, ce qui pourrait fluctuer au fil du temps, par l'opération d'un canal de laser de référence 11,15 La deuxième étape critique est la collecte précise et la co-registration de l'imagerie anatomique pour les reconstructions guidées fluorescence Les données FT offre à lui seul aucune information anatomique.; Par conséquent, afin de créer un modèle de transport de la lumière qui peut être utilisé pour reconstruire le lodes sources de cations fluorescentes dans un échantillon de la fluorescence détectée à la surface de l'échantillon, l'anatomie de l'échantillon par rapport au système FT doit être connue avec précision. Dans notre système, l'information anatomique est acquise par un système de tomographie micro-calculée avec des coordonnées spatiales qui ont été enregistrés dans l'espace avec ceux du système FT 15,20. La troisième étape critique consiste à veiller à ce qu'une exposition optimale (c.-à-temps total de la détection de photons pour chaque projection par laser) est utilisé à chaque position de la source-détecteur. Ceci est important pour deux raisons: premièrement, faire en sorte qu'il y ait suffisamment de signal-bruit à chaque détection de la position et la seconde pour éviter la saturation du détecteur, ce qui pourrait endommager les unités de détection. Pour obtenir une exposition optimale à chaque position du détecteur, un contrôle d'exposition automatique est utilisé, ce qui triangule essentiellement l'exposition optimale à partir de deux, à faible signal de l'exposition 14. La critique quatrièmel'étape de la méthode est référençant les données collectées à fluorescence la quantité de lumière d'excitation émise. Ce référencement est souvent appelé le rapport Né, et offre de nombreux avantages pour FT, dont le principal étant une atténuation des erreurs d'incompatibilité des données du modèle 23,24. Le système présenté a été conçu pour détecter la lumière d'excitation à la fois par fluorescence et transmis simultanément en canalisant la lumière dans chaque canal de détection en 2 tubes photomultiplicateurs distincts. En faisant cela, nous évitons les effets du mouvement sur l'exactitude du ratio de Born.Avec un ensemble de données robuste, il part, la reconstruction d'image de temps-domaine de données implique la résolution du problème inverse de la maillage d'éléments finis ayant l'expression:
d = Jx
où d est un vecteur de n éléments x m pour n source-détecteur et les projections m TPSF temps barrières; J est un n x m-par-l sensibilité matrice (ou jacobienne), pour les noeuds du maillage l, et x est le vecteur de fluorescence des propriétés optiques dans chaque noeud, ayant une taille L d est les données étalonnées collectées au cours du test et J est simulé en utilisant la solution d'éléments finis. à l'approximation de la diffusion dans le domaine temporel de transport de fluorescence 25. La dimension temps de J est également convolution avec les détecteurs spécifiques fonctions de réponse de l'instrument. X est une représentation de la carte de fluorescence d'intérêt et est résolu pour l'aide d'un Levenberg-Marqardt non négatif au approche carrés avec Tikhonov régularisation 15.
La méthodologie présentée ici, qui décrit une procédure capable de localiser les tumeurs marquées par fluorescence dans des souris en utilisant très sensibles à comptage de photons détection par fluorescence, a le potentiel de repousser les limites de FT. Dans une étude précédente, le potentiel de l'utilisation de cetteapproche plus grands que les souris modèles animaux, tels que les rats, ainsi que la sensibilité améliorée par rapport à la conception des systèmes existants chez la souris de la taille des spécimens, a été démontrée 17. L'application immédiate de cette approche serait pour le suivi de l'expression des biomarqueurs in vivo dans des modèles tumoraux de petits animaux pour évaluer l'efficacité des médicaments dans un moyen à haut débit. La capacité du système pour exciter et détecter la fluorescence à des longueurs d'onde multiples permet la détection simultanée de marqueurs fluorescents multiples. D'autres marqueurs fluorescents fournir un moyen d'interroger les multiples aspects d'une pathologie, simultanément, ou pourraient être utilisées, comme dans cette étude, d'employer des méthodes d'imagerie plus quantitatives telles que la double-journaliste méthodes de mesure du potentiel de liaison in vivo, un marqueur de la densité des récepteurs 26,27.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été financé par des subventions du National Cancer Institute R01 CA120368, R01 CA109558 (KMT, CEP, FEG, BWP), RO1 CA132750 (MJ, BWP) et K25 CA138578 (FL), et les Instituts canadiens de recherche en santé bourse postdoctorale (KMT ). Le développement du système de tomographie par fluorescence a été partiellement financé par Recherches et Technologies Avancées (Montréal, QC).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
IRDye 800CW-EGF | LI-COR Biosciences | 926-08446 | |
Alexa Fluor 647, succinimidyl ester | Life Technologies | A20106 | Reacted with water to minimize non-specific binding |