التصوير المقطعي مضان منتشر يقدم نهجا منخفضة التكلفة نسبيا ويحتمل أن تكون عالية في جميع أنحاء إلى ما قبل السريرية<em> في الجسم الحي</em> التصوير الورم. يتم تقديم منهجية لجمع البيانات البصرية، والمعايرة، وإعادة بناء صورة عن التصوير المقطعي الموجهة محسوب نظام للوقت نطاق عدم الاتصال باستخدام فلوري استهداف العلامات البيولوجية ورم البشرة مستقبلات عوامل النمو في الفأر نموذج دبقي.
Small animal fluorescence molecular imaging (FMI) can be a powerful tool for preclinical drug discovery and development studies1. However, light absorption by tissue chromophores (e.g., hemoglobin, water, lipids, melanin) typically limits optical signal propagation through thicknesses larger than a few millimeters2. Compared to other visible wavelengths, tissue absorption for red and near-infrared (near-IR) light absorption dramatically decreases and non-elastic scattering becomes the dominant light-tissue interaction mechanism. The relatively recent development of fluorescent agents that absorb and emit light in the near-IR range (600-1000 nm), has driven the development of imaging systems and light propagation models that can achieve whole body three-dimensional imaging in small animals3.
Despite great strides in this area, the ill-posed nature of diffuse fluorescence tomography remains a significant problem for the stability, contrast recovery and spatial resolution of image reconstruction techniques and the optimal approach to FMI in small animals has yet to be agreed on. The majority of research groups have invested in charge-coupled device (CCD)-based systems that provide abundant tissue-sampling but suboptimal sensitivity4-9, while our group and a few others10-13 have pursued systems based on very high sensitivity detectors, that at this time allow dense tissue sampling to be achieved only at the cost of low imaging throughput. Here we demonstrate the methodology for applying single-photon detection technology in a fluorescence tomography system to localize a cancerous brain lesion in a mouse model.
The fluorescence tomography (FT) system employed single photon counting using photomultiplier tubes (PMT) and information-rich time-domain light detection in a non-contact conformation11. This provides a simultaneous collection of transmitted excitation and emission light, and includes automatic fluorescence excitation exposure control14, laser referencing, and co-registration with a small animal computed tomography (microCT) system15. A nude mouse model was used for imaging. The animal was inoculated orthotopically with a human glioma cell line (U251) in the left cerebral hemisphere and imaged 2 weeks later. The tumor was made to fluoresce by injecting a fluorescent tracer, IRDye 800CW-EGF (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) targeted to epidermal growth factor receptor, a cell membrane protein known to be overexpressed in the U251 tumor line and many other cancers18. A second, untargeted fluorescent tracer, Alexa Fluor 647 (Life Technologies, Grand Island, NY) was also injected to account for non-receptor mediated effects on the uptake of the targeted tracers to provide a means of quantifying tracer binding and receptor availability/density27. A CT-guided, time-domain algorithm was used to reconstruct the location of both fluorescent tracers (i.e., the location of the tumor) in the mouse brain and their ability to localize the tumor was verified by contrast-enhanced magnetic resonance imaging.
Though demonstrated for fluorescence imaging in a glioma mouse model, the methodology presented in this video can be extended to different tumor models in various small animal models potentially up to the size of a rat17.
مضان التصوير المقطعي (FT) هو، المؤينة الحساسة إشعاع حر طريقة التصوير الجزيئي على أساس نقل الضوء المرئي والأشعة تحت الحمراء بالقرب من خلال الأنسجة البيولوجية. وقد تركز معظم الاهتمام في FT في قدرتها على تسريع اكتشاف المخدرات والتنمية في الحيوانات الصغيرة نماذج تجريبية (1) واحدة من المجالات الرئيسية للبحوث وكانت دراسة التعبير العلامات البيولوجية السرطان وردا على العلاجات الجزيئية 26. في الوقت الحاضر، هناك طريقتان للتنافس على تصميم نظام FT. يرتكز في تصميمه الأكثر شيوعا في تبريد المسؤول عن الكاميرات الديناميكي (CCD) جهاز للكشف عن مضان 4-9. هذا التصميم يوفر كثافة عالية من القياسات، وأخذ عينات الأنسجة منذ تعظيم كل بكسل في كاميرا CCD يمكن الكشف عن الضوء الذي قد سافر مسار فريدة من نوعها من خلال النسيج. ومع ذلك، والكاميرات لاتفاقية مكافحة التصحر لديها مجموعة محدودة ديناميكية وقراءة خارج الضوضاء يحد من حساسية في نهاية المطاف. تصميم 2 يتجنب limita المحتملة ستعقد من كشف كاميرا CCD من خلال توظيف تكنولوجيا حساسة للغاية العد واحد الفوتون تعتمد على استخدام أجهزة الكشف عن مثل أنابيب مضخم ضوئي أو فوتوديوديس سيل 10-13. العيب من هذه الأساليب اكتشاف أكثر حساسية هو أن كل كاشف يمكن جمع ضوء فقط في نقطة واحدة، وبالتالي، لتحقيق كثافة أخذ عينات الأنسجة، وإما للكشف عن كثير لا بد من استخدامها (وهو أمر مكلف جدا)، أو توقعات كثير لا بد من تصوير مع الكشف عن نفسه (والذي يمكن أن يكون مضيعة للوقت). في حين أن المستوى الأمثل للأخذ عينات الأنسجة لFT حيوان صغير لم يتم الاتفاق عليها، ويمكن أن تختلف على أساس كل حالة على حدة، من المتفق عليه أن هو أكثر ملاءمة أحادية الفوتون الأجهزة عد لاستكشاف حدود حساسية من حيث FT من قدرتها على الكشف عن تركيزات منخفضة من المؤشرات الجزيئية. في هذه الدراسة، ونحن نقدم منهجية لتنفيذ FT باستخدام واحد الفوتون أجهزة كشف الحساب في توطين الاورام في الفئران.
والأنف والحنجرة "> هناك أربع خطوات حاسمة المعنية لإنتاج مجموعات بيانات قوية مع FT أحادية الفوتون الوقت مترابطة العد. الأول هو الخضوع لإجراء معايرة مناسبة ومباشرة. في المنهجية المقدمة، تحتسب الحساسيات الخاصة بكل قناة كشف عن طريق جمع قياس خط الأساس للضوء الإثارة التي تنتقل عن طريق diffusor الخط تهدف إلى توجيه أجزاء متساوية من الضوء على كل كشف 15. وعلاوة على ذلك، يتم معايرة بشكل مستمر على ضوء الكشف عن أثناء تجربة لمرجع ليزر، سواء من حيث الكثافة وتعني . في الوقت الذي يمكن أن تتقلب مع مرور الوقت، من خلال تشغيل قناة مرجع ليزر 11،15 الخطوة الثانية الحاسمة هي مجموعة دقيقة والمشارك التسجيل من الصور التشريحية لاعادة البناء مضان موجه البيانات FT تقدم وحدها أي معلومات تشريحية. ولذلك، من أجل خلق نموذج وسائل النقل الخفيفة التي يمكن استخدامها لإعادة بناء الصغرىالكاتيون من مصادر فلوري خلال عينة من مضان الكشف على سطح العينة، لا بد من تشريح العينة بالنسبة إلى نظام FT معروف بدقة. في نظامنا، ويتم الحصول على المعلومات التشريحية عن طريق نظام التصوير المقطعي الصغيرة المحسوبة مع الإحداثيات المكانية التي تم تسجيلها مكانيا مع تلك التابعة لمنظومة FT 15،20. الخطوة الثالثة الحاسمة ينطوي على ضمان أن يعمل التعرض الأمثل (أي مجموع وقت كشف الفوتون لكل إسقاط ليزر) في كل موقف للكشف عن المصدر. وهذا أمر مهم لسببين: أولا، لضمان عدم وجود إشارة كافية إلى الضجيج في كل موقف الكشف والثاني لتجنب الكشف عن التشبع، والتي يمكن ان يلحق الضرر وحدات الكشف. من أجل تحقيق التعرض الأمثل في كل موقف كاشف، يعمل عنصر تحكم التعرض التلقائي، الذي triangulates أساسا التعرض الأمثل من اثنين، ومنخفضة التعرض للإشارة 14. الحرجة 4خطوة من خطوات منهجية يتم الرجوع إلى البيانات التي تم جمعها مضان على كمية الضوء إثارة المنقولة. وغالبا ما تسمى هذه الإشارة إلى نسبة ولد، وتوفر العديد من المزايا لFT، مع أهمها التخفيف من أخطاء عدم تطابق نموذج البيانات 23،24. تم تصميم هذا النظام قدم لكشف كل من التألق وينتقل ضوء الإثارة في وقت واحد عن طريق توجيه الضوء في كل قناة الاكتشاف الى 2 أنابيب مضخم ضوئي منفصلة. من خلال ذلك، يمكننا تجنب أي تأثيرات الحركة على دقة نسبة ولد.مع مجموعة بيانات قوية يدها، وإعادة بناء صورة من الوقت للنطاق البيانات ينطوي على حل مشكلة معكوس شبكة العناصر المحدودة لديها التعبير:
د = JX
حيث d هو متجه مع عناصر ن متر x لتوقعات المصدر كشف n و m TPSF بوابات الزمن؛ J هو ن س م على حدةل مصفوفة حساسية (أو Jacobian)، لعقد لتر في شبكة، وx هو متجه من الخصائص البصرية مضان في كل عقدة، وكان ل د هو حجم البيانات التي تم جمعها خلال معايرة التجربة وجيه هو محاكاة باستخدام حل العناصر المحددة. لنشر تقريب وقت مجال النقل مضان 25. وconvolved أيضا في الوقت البعد من J مع كاشف وظائف معينة استجابة الصك. x هو تمثيل لخريطة مضان من الاهتمام ويتم حلها عن استخدام Levenberg-Marqardt غير سلبي نهج المربعات مع تنظيم تيخونوف 15.
عرض منهجية هنا، والذي يصف إجراء قادرة على توطين أورام fluorescently المسمى في الفئران باستخدام درجة عالية من الحساسية الفوتون عد الكشف عن مضان، لديه القدرة على دفع حدود FT. في دراسة سابقة، فإن إمكانية توظيف هذاوقد تجلى في نهج أكبر من الفئران نماذج الحيوانات مثل الفئران، وكذلك تحسين الحساسية أكثر من التصاميم النظام القائم في فأر بحجم العينات، 17. فإن التطبيق الفوري لهذا النهج أن يكون لرصد التعبير العلامات البيولوجية في الجسم الحي في نماذج ورم صغير الحيوان لتقييم فعالية الدواء في وسيلة عالية الإنتاجية. قدرة نظام لإثارة وكشف مضان في موجات متعددة في وقت واحد يسمح للكشف عن علامات فلوري متعددة. علامات فلوري إضافية توفر وسيلة لاستجواب جوانب متعددة من علم الأمراض، في وقت واحد، أو يمكن أن تستخدم، كما هو الحال في هذه الدراسة، لتوظيف المناهج التصوير أكثر كمي مثل ثنائي مراسل طرق قياس في إمكانية ملزم الجسم الحي، علامة على كثافة مستقبلات 26،27.
The authors have nothing to disclose.
وقد تم تمويل هذا العمل عن طريق منح المعهد الوطني للسرطان في R01 CA120368، R01 CA109558 (حزب الكومينتانغ، RWH، FEG، BWP)، RO1 CA132750 (MJ، BWP) و K25 CA138578 (فلوريدا)، والكندية معاهد جائزة بحوث صحة زمالة ما بعد الدكتوراه (حزب الكومينتانغ ). وقد تم تمويل جزء من تطوير نظام التصوير المقطعي مضان بواسطة تقنيات البحث المتقدمة (مونتريال، QC).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
IRDye 800CW-EGF | LI-COR Biosciences | 926-08446 | |
Alexa Fluor 647, succinimidyl ester | Life Technologies | A20106 | Reacted with water to minimize non-specific binding |