Agaroz jel elektroforez ile DNA parçalarının ayrılması için temel bir protokol tarif edilmektedir.
Agaroz jel elektroforezi 100 bp den 25 kb 1 arasında değişen boyutlarda DNA parçaları ayıran en etkili yoludur. Agaroz deniz yosunu cins Gelidium ve Gracilaria izole edilen ve tekrarlanan agarobiose (L-ve D-galaktoz) alt birimlerinin 2 oluşur. Jelleşme sırasında, agaroz polimerler non-kovalent ilişkilendirmek ve gözenek boyutları bir jel moleküler eleme özelliklerini belirlemek demetleri bir ağ oluştururlar. Agaroz jel elektroforezi kullanımı DNA ayrılması devrim. Agaroz jel onaylanmasından önce, DNA öncelikle sadece boyut bir yaklaşım sağlanır sükroz yoğunluk gradient santrifüj kullanılarak ayrıldı. Agaroz jel elektroforez ile DNA ayırmak için, DNA jel ve uygulanan akım önceden dökme kuyulara yüklenir. DNA (RNA) molekülün fosfat omurgası olumsuz bir elektrik alanı yerleştirildiği zaman, bu nedenle, şarj edilmiş, DNA fragmanları p göçedecektirositively anot ücret. DNA üniform bir kütle / yük oranına sahip olduğu için, DNA molekülleri, yapılan yol moleküler ağırlığının 3 log ile ters orantılı olduğu gibi bir kalıp içinde bir agaroz jeli içinde boyutu ile birbirinden ayrılır. Bir agaroz jeli ile DNA hareketi için öncü modelinin ön kenarı ileriye doğru hareket eder ve 4 boyunca molekülün geri kalan çeker sayede, "reptation yanlı" edilir. ; 2) agaroz konsantrasyonu; 3) DNA yapısı 5; 4) etidyum bromid, 6 arasında uygulanan gerilim, 5) bulunması) türü DNA molekülü 1) boyutu: bir jel yoluyla bir DNA molekülü göç oranı aşağıdaki tarafından belirlenir agaroz ve 7) elektroforez tamponu. Ayırma işleminden sonra, DNA molekülleri uygun bir boya ile boyama sonra UV ışığı altında görüntülendi olabilir. Bu protokolü takip ederek, öğrenciler olmalıdır:
Agaroz jel elektroforezi nükleik asitlerin ayıran etkin ve etkili bir yol olduğu kanıtlanmıştır. Agaroz yüksek jel gücünde büyük DNA parçalarının ayrılması için düşük yüzde jeller kullanılmasını sağlar. Molekül eleme jel matris içinde agaroz 7 demetler tarafından üretilen gözeneklerin büyüklüğü ile belirlenir. Genel olarak, agaroz, küçük gözenek büyüklüğü ve daha yüksek konsantrasyonda. Geleneksel agaroz jeller 100 bp ve 25 kb arasında DNA parçalarının ayrılması en fazla etkilidir. 25 kb daha büyük DNA parçaları ayırmak için, bir iki farklı yönden gelen alternatif akım uygulama içerir darbe alan jel elektroforezi 6, kullanmanız gerekecektir. Bu şekilde, daha büyük ölçekli DNA fragmanları bunlar mevcut yönde değişiklik ile kendilerini reorient hızını ile birbirinden ayrılır. 100 bp daha küçük DNA parçaları daha etkili bir şekilde poliakrilamid jel elektroforez ile birbirinden ayrılır. Aksineagaroz jel, poliakrilamid jel matris bir serbest radikal tahrik kimyasal reaksiyon ile oluşturulur. Bu ince jeller, yüksek konsantrasyon olan dikey çalıştırılır ve daha iyi çözünürlüğe sahiptir. Kapiler elektroforez sıralama Modern DNA kullanılır ise, bu sayede kılcal tüpler bir jel matriks ile doludur. Kılcal tüp kullanımı ve böylece hızlı DNA parçalarının ayrılması (ve DNA dizisinin belirlenmesi) sağlayarak, yüksek voltaj uygulama için olanak sağlar.
Agaroz hydroxyethylation yoluyla düşük erime agaroz oluşturmak için değiştirilebilir. Düşük erime agaroz genellikle ayrılmış DNA parçalarının izolasyonu istendiği zaman kullanılır. Hydroxyethylation etkin bir şekilde gözenek büyüklüğüne 8 azaltarak agaroz demetleri ambalaj yoğunluğu, azaltır. Bu, aynı boyda DNA fragmanı olarak, bir standart agaroz jel aksine, bir düşük erime agaroz jel üzerinde hareket etmek için daha uzun zaman alacaktır anlamına gelir. Demetleri birbirleriyle ilişkilendirmek içinayarlayın sonra kovalent olmayan etkileşimler ile 9, yeniden erir bir agaroz jel mümkündür.
EtBr agaroz jel 10 DNA leke için kullanılan en yaygın reaktif. UV ışığa maruz kaldığında, etidyum molekülün aromatik halkanın elektron aktive edilir, hangi zemin durumuna elektronların dönüş olarak enerji (ışık) salınımına yol açar. EtBr, konsantrasyon bağımlı bir tarzda DNA molekülü başına araya ilave olarak çalışmaktadır. Bu yoğunluğu göre, herhangi bir DNA bandında DNA miktarı tahminine sağlar. Çünkü olumlu ücret, EtBr kullanımı% 15 oranında DNA göç hızı azaltır. EtBr bir şüphelinin mutajen ve kanserojen olduğu, bu nedenle içeren agaroz jel işlerken bir özen gerekir. Ayrıca, EtBr bir tehlikeli atık olarak kabul edilir ve uygun şekilde bertaraf edilmelidir. Agaroz jel DNA Alternatif lekeleri SYBR Altın, SYBR yeşil, Kristal Mor ve Metil Mavi içerir. Bunlardan,Metil Blue ve kristal viyole jelden DNA fragmanının geri kazanım isteniyorsa böylece mutasyon olasılığı azaltarak, DNA gruplarından görüntülenmesi için UV ışığı jel maruz gerekmez. Bununla birlikte, kendi duyarlılıkları EtBr göre daha düşüktür. SYBR altın ve SYBR yeşil EtBr daha düşük toksisite ile hem çok hassas, uv bağımlı boyalar, ancak çok daha pahalıdır. Dahası, bütün alternatif boyaların olamaz biri ya da jel doğrudan ilave edildiği zaman iyi iş değildir, bu nedenle jel elektroforezi sonra mesaj lekeli olması gerekmektedir. Çünkü maliyet, kullanım kolaylığı ve hassasiyeti, EtBr hala birçok araştırmacı için tercih edilen boya kalır. Ancak, bu tür tehlikeli atık bertaraf zor veya genç öğrenciler olduğu gibi bazı durumlarda, bir deney performans, daha az toksik bir boya tercih edilebilir.
Jel elektroforez kullanılan yükleme boyalar üç ana amaca hizmet eder. Önce örnek yoğunluğu ekleyinBu jel içine batırmak olanak tanır. İkincisi, boyaların renk sağlamak ve yükleme işlemini basitleştirmek. Son olarak, boyalar DNA parçacıkları göç etmiş olduğu mesafe tahmini için izin jel ile standart tarife üzerinden hareket ettirin.
Ayrılan DNA parçalarının kesin boyutlar her bandın tarafından katedilen mesafe karşı bir DNA standart farklı bantlar için moleküler ağırlığa sahip log çizerek belirlenir. DNA standardı bilinmeyen DNA örnekleri karşı mukayese edilebilir önceden belirlenmiş boyutlardaki DNA parçalarının bir karışımını içeriyor. DNA'nın farklı formları farklı oranlarda jel üzerinde hareket dikkat etmek önemlidir. Supercoiled plazmid DNA, çünkü kompakt konformasyon, yavaş hareket açık dairesel bir formu ile aynı boyutta doğrusal bir DNA parçası, ardından hızlı jeli içinden geçmektedir.
Sonuç olarak, DNA ayrılması için 1970'lerde agaroz jeller kabulünden bu yana, varbiyolojik bilimler araştırma en kullanışlı ve çok yönlü tekniklerinden biri olduğu kanıtlanmıştır.
The authors have nothing to disclose.
Name of reagent | Company | Catalog number | コメント |
Agarose I | Amresco | 0710 | |
Boric acid | Sigma | B7901 | |
Bromophenol blue | Sigma | B8026 | |
EDTA | Sigma | E9884 | |
Ethidium bromide | Sigma | E7637 | Carcinogenic-needs to be disposed of as hazardous waste |
Glacial acetic acid | Fisher | BP2401-212 | Corrosive |
Glycerol | Fisher | G33-1 | |
Xylene cyanol FF | Sigma | X4126 | |
Tris base | Sigma | T1503 | |
Investigator/FX gel documentation system | Fotodyne | ||
Owl Easycast B1 mini gel electrophoresis system | Thermo Scientific | B1-PTM | |
EPS 301 power supply | GE Healthcare | 18-1130-01 |