Agarosegel-Elektrophorese für die Trennung von DNA-Fragmenten

Agarosegelelektrophorese hat sich als effiziente und effektive Art und Weise der Trennung von Nukleinsäuren sein. Agarose die hohe Gelfestigkeit kann für die Behandlung von geringen Prozentsatz Gele für die Trennung von großen DNA-Fragmenten. Molekularsiebkohle wird durch die Größe der Poren durch die Bündel von Agarose ⁷ in der Gelmatrix erzeugt wird. Im Allgemeinen, je höher die Konzentration von Agarose, desto kleiner ist die Porengröße. Traditionelle Agarosegelen sind am effektivsten bei der Trennung von DNA-Fragmenten zwischen 100 bp und 25 kb. Um DNA-Fragmente, die größer als 25 kb zu trennen, wird eine Notwendigkeit, Puls-Feld-Gelelektrophorese ^6, die die Anwendung von Wechselstrom aus zwei unterschiedlichen Richtungen einbezogen werden, verwenden. Auf diese Weise größer dimensionierte DNA-Fragmente werden durch die Geschwindigkeit, mit der sie sich neu orientieren mit den Änderungen in der aktuellen Richtung getrennt ist. DNA-Fragmente kleiner als 100 bp getrennt sind wirksamer unter Verwendung von Polyacrylamidgel-Elektrophorese. Im Gegensatz zuAgarosegelen, wird das Polyacrylamid-Gel-Matrix durch eine Radikalpolymerisation angetriebenen chemischen Reaktion gebildet. Diese Gele sind dünner höherer Konzentration, sind vertikal verlaufen und haben eine bessere Auflösung. In der modernen DNA-Sequenzierung Kapillarelektrophorese verwendet wird, wobei Kapillarröhrchen mit einer Gelmatrix gefüllt. Die Verwendung von Kapillarröhrchen ermöglicht die Anwendung von hohen Spannungen, wodurch die Trennung von DNA-Fragmenten (und die Bestimmung der DNA-Sequenz) schnell.

Agarose kann modifiziert werden, um niedrig schmelzende Agarose durch Hydroxyethylierung zu erstellen. Niedrig schmelzende Agarose wird im Allgemeinen verwendet, wenn die Isolierung von DNA-Fragmenten getrennt erwünscht ist. Hydroxyethylierung verringert die Packungsdichte der Agarose-Bundles, eine effektive Senkung ihrer Porengröße ^8. Dies bedeutet, dass ein DNA-Fragment der gleichen Größe länger dauert, bis durch eine leicht schmelzendem Agarosegel, um ein Standard-Agarosegel gegenüberliegenden bewegen. Da die Bündel miteinander verbindendurch nicht-kovalente Wechselwirkungen ^9, ist es möglich, wieder schmilzt ein Agarosegel nach der Aushärtung.

EtBr ist die häufigste Reagenz verwendet, um DNA in Agarosegelen ¹⁰ zu färben. Wenn UV-Licht ausgesetzt, Elektronen in dem aromatischen Ring der Ethidium-Molekül aktiviert werden, führt die zur Freisetzung von Energie (Licht) als Elektronen zurück zum Grundzustand. EtBr funktioniert durch Einlagern sich in der DNA-Moleküls in einer konzentrationsabhängigen Weise. Dies ermöglicht eine Abschätzung der Menge an DNA in einer bestimmten DNA-Bande auf ihrer Intensität. Aufgrund seiner positiven Ladung reduziert die Verwendung von EtBr die DNA-Migration Rate um 15%. EtBr ist ein Verdächtiger mutagen und karzinogen, also muss man Vorsicht walten lassen beim Umgang mit Agarosegelen enthält es. Darüber hinaus ist EtBr als Sondermüll und müssen entsprechend entsorgt werden. Alternative Flecken für DNA in Agarosegelen gehören SYBR Gold, SYBR Green, Kristallviolett und Methyl Blue. Von diesenMethyl Blue, Crystal Violet erfordern keine Exposition des Gels mit UV-Licht zur Visualisierung von DNA-Banden, wodurch die Wahrscheinlichkeit der Mutation wenn die Wiederherstellung der DNA-Fragment aus dem Gel gewünscht wird. Allerdings sind die Empfindlichkeiten niedriger als die von EtBr. SYBR Gold und SYBR Green sind beide sehr empfindlich, UV-abhängige Farbstoffe mit geringere Toxizität als EtBr, aber sie sind wesentlich teurer. Darüber hinaus, alle alternativen Farbstoffe können entweder nicht oder nicht gut funktionieren, wenn sie direkt zu dem Gel gegeben, damit das Gel muss nach gebeizt nach der Elektrophorese. Wegen der Kosten, einfache Handhabung, und die Empfindlichkeit, EtBr bleibt noch der Farbstoff der Wahl für viele Forscher. Doch in bestimmten Situationen, z. B. wenn die Entsorgung gefährlicher Abfälle ist schwierig, oder wenn junge Studenten sind der Durchführung eines Experiments kann eine weniger giftige Farbstoff bevorzugt werden.

Lädt Farbstoffe in Gel-Elektrophorese verwendet dienen drei wichtige Zwecke. Zuerst fügen sie hinzu Dichte der Probe, So dass sie in das Gel zu versenken. Zweitens bieten die Farbstoffe Farbe und den Ladevorgang zu vereinfachen. Schließlich bewegen sich die Farbstoffe in Regelsätze durch das Gel, so dass für die Abschätzung der Entfernung, die DNA-Fragmente migriert.

Die genaue Größe der aufgetrennten DNA-Fragmente können durch Auftragen der log des Molekulargewichts für die verschiedenen Bereiche von einer DNA-Standard gegen den Abstand von jedem Band erneut bestimmt werden. Die DNA-Standard enthält eine Mischung von DNA-Fragmenten von vorbestimmten Größen, die gegen die unbekannten DNA-Proben verglichen werden können. Es ist wichtig zu beachten, dass verschiedene Formen von DNA durch das Gel mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten bewegen. Superspiralisierter Plasmid-DNA, aufgrund ihrer kompakten Konformation, bewegt sich durch das Gel am schnellsten, gefolgt von einem linearen DNA-Fragment der gleichen Größe, mit der offenen Kreisform reisen die langsamste.

Abschließend, da die Annahme von Agarosegelen in den 1970er Jahren für die Trennung von DNA, hatsich als eines der nützlichsten und vielseitigsten Techniken in den biologischen Wissenschaften Forschung sein.