DNA断片の分離のためのアガロースゲル電気泳動
概要
アガロースゲル電気泳動を用いたDNA断片の分離のための基本的なプロトコルが記述されています。
Abstract
アガロースゲル電気泳動で100 bpから25キロバイト1までさまざまなサイズのDNA断片を分離する最も効果的な方法です。アガロースは、海藻テングサ属とオゴノリから分離され、繰り返しagarobiose（L-およびD-ガラクトース）のサブユニット2から構成されています。ゲル化時には、アガロースポリマーは、非共有結合的に関連付け、孔径ゲルの分子ふるい特性を決定するバンドルのネットワークを形成しています。アガロースゲル電気泳動の使用は、DNAの分離に革命をもたらしました。アガロースゲルの採択に先立ち、DNAは、主にのみサイズの近似値を提供してショ糖密度勾配遠心法を用いて分離した。アガロースゲル電気泳動を使用して、別のDNAに、DNAは、ゲルと印加される電流にプレキャストウェルにロードされます。 DNA（およびRNA）分子のリン酸バックボーンは負電場に置かれたとき、したがって、充電され、DNA断片は、pに移行しますositivelyアノードを充電されます。 DNAが均一な質量/電荷比を持つため、DNA分子が移動する距離は、その分子量3のログに反比例するようなパターンで、アガロースゲル内のサイズで区切られています。アガロースゲルを介してDNAの動きのための主要なモデルは、リーディングエッジが前方に移動し、4に沿って分子の残りの部分を引っ張ることにより、 "レプにバイアス"です。 2）アガロース濃度、3）DNAのコンフォメーション5、4）臭化エチジウム、6の電圧が適用され、5）が存在する）タイプのDNA分子の1）サイズ：ゲルを介してDNA分子の移動速度は、次の要素によって決まりますアガロースおよび7）電気泳動用バッファーの。分離した後、DNA分子は、適切な染料で染色した後、UV光下で可視化することができる。このプロトコルに従うことによって、学生のことができるようになります。
- DNA断片をゲルマトリックス内に分離されているメカニズムを理解する
- のコンフォメーション方法を理解するDNA分子はゲルマトリックスを通じて、モビリティを決定します
- 彼らのニーズに合わせて適切な濃度のアガロース溶液を識別する
- DNAサンプルの電気泳動用アガロースゲルを準備します。
- ゲル電気泳動装置と電源を設定する
- DNA断片の分離に適した電圧を選択します。
- エチジウムブロマイドはDNAバンドの可視化を可能にするメカニズムを理解する
- 分離したDNA断片のサイズを決定
Protocol
Discussion
アガロースゲル電気泳動は、核酸を分離する効率的かつ効果的な方法であることが証明されています。アガロースの高いゲル強度は、大規模なDNA断片を分離するための割合が低いゲルの処理を行うことができます。分子ふるいは、ゲルマトリックス内のアガロース7のバンドルによって生成された細孔のサイズによって決まります。一般的に、アガロース、より小さい細孔径のより高い濃度である。従来のアガロースゲルは、100 bpと25キロバイトの間でDNA断片の分離に最も効果的です。 25キロバイトより大きいDNA断片を分離するために、1つは、2つの異なる方向からの交流電流のアプリケーションが含まれ、パルスフィールドゲル電気泳動法6を使用する必要があります。このように大きなサイズのDNA断片は、それらが現在の方向の変化に自分自身を再方向付けする速度で区切られています。 100 bp未満のDNA断片がより効果的にポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて分離されています。とは異なり、アガロースゲル、ポリアクリルアミドゲルマトリックスは、フリーラジカル主導の化学反応により形成されています。これらの薄いゲルは、高い濃度である垂直に実行され、良好な分解能を持っています。キャピラリー電気泳動シーケンシング現代のDNAが使用されているで、それによってキャピラリーチューブはゲルマトリックスで充填される。キャピラリーチューブの使用は、それによって迅速にDNA断片の分離（およびDNA配列の決定）を有効にする、高電圧の印加が可能になります。
アガロースは、ヒドロキシエチル化によって低融点アガロースを作成するために変更することができます。低融点アガロースは、一般的に分離したDNA断片の分離が望まれているときに使用されます。ヒドロキシエチル化が効果的に細孔サイズ8を減らし、アガロースバンドルの充填密度を減らすことができます。これは、同じ大きさのDNA断片は、標準的なアガロースゲルとは対照的に低融点アガロースゲルを介して移動に時間がかかることを意味します。バンドルには、お互いに関連付けるためそれが設定された後に非共有結合的相互作用9を介して、それが再溶解アガロースゲル電気泳動することが可能です。
EtBrを、アガロースゲル10でDNAを染色するために使用される最も一般的な試薬です。紫外線にさらされると、エチ分子の芳香環の電子は電子が基底状態に戻るようにエネルギーの放出（光）につながる、活性化される。 EtBrを、濃度依存的にDNA分子に自分自身を挿入することによって動作します。これは、その強度に基づいて、任意の特定のDNAバンドのDNA量の推定が可能になります。ため、その正電荷が、EtBrを使用すると、15％のDNAの移動速度を減少させる。 EtBrを容疑者変異原性と発がん性物質である、従ってそれを含むアガロースゲルを取り扱う際に一つ注意しなければなりません。さらに、EtBrをは有害廃棄物とみなされ、適切に廃棄する必要があります。アガロースゲル中のDNAのための代替染色はSYBRゴールド、SYBRグリーン、クリスタルバイオレット、メチルブルーが含まれています。これらの、メチルブルーとクリスタルバイオレットは、ゲルからDNA断片の回収が必要な場合は、それによって突然変異の確率を減少させる、DNAバンドの可視化のための紫外光へのゲルの露出を必要としません。しかし、その感度はEtBrをより低くなっています。 SYBR金とSYBRグリーンはEtBrをより低い毒性の両方で高感度、UV依存染料であるが、それらはかなり高価です。また、代替染料のすべてのことはできませんいずれか、またはゲルに直接添加したときにうまく機能しない、したがって、ゲル電気泳動後のポストで染色しなければならないでしょう。ので、コスト、使いやすさ、感度の、EtBrを、まだ多くの研究者のための選択の染料のままです。しかし、このような有害廃棄物処理が困難な場合や、若い学生である場合など、特定の状況で実験を行っている、毒性の少ない染料が好ましい可能性があります。
ゲル電気泳動に使用されるローディングの染料は、三大目的があります。最初に、彼らは、サンプルに密度を追加する、それがゲルにシンクすることができます。第二に、染料の色を提供し、ロード·プロセスを簡素化します。最後に、色素は、DNA断片が移行した距離の推定を可能にし、ゲルを介して標準的な速度で移動します。
分離したDNA断片の正確なサイズは、各バンドが移動した距離に対するDNA基準の異なるバンドの分子量の対数をプロットすることにより決定することができます。 DNA標準では、未知のDNAサンプルと比較することができますあらかじめ決められたサイズのDNA断片の混合物を含んでいます。それはDNAの異なる形態が異なる速度でゲル内を移動することに注意することが重要です。スーパーコイルプラスミドDNAは、ため、そのコンパクトな立体構造の、最も遅い走行開いた円形のフォームと同じ大きさの直鎖状DNA断片、続いて、最速のゲルを通して移動します。
結論としては、DNAの分離のための1970年代のアガロースゲルを採用しているので、それが持つ生物科学研究の中で最も有用と多彩な技術の一つであることが証明されています。
開示
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalog number | コメント |
| Agarose I | Amresco | 0710 | |
| Boric acid | Sigma | B7901 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B8026 | |
| EDTA | Sigma | E9884 | |
| Ethidium bromide | Sigma | E7637 | Carcinogenic-needs to be disposed of as hazardous waste |
| Glacial acetic acid | Fisher | BP2401-212 | Corrosive |
| Glycerol | Fisher | G33-1 | |
| Xylene cyanol FF | Sigma | X4126 | |
| Tris base | Sigma | T1503 | |
| Investigator/FX gel documentation system | Fotodyne | ||
| Owl Easycast B1 mini gel electrophoresis system | Thermo Scientific | B1-PTM | |
| EPS 301 power supply | GE Healthcare | 18-1130-01 |
参考文献
- Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular Cloning. , (2001).
- Kirkpatrick, F. H. Overview of agarose gel properties. Electrophoresis of large DNA molecules: theory and applications. , 9-22 (1991).
- Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. Analysis of endonuclease R•EcoRI fragments of DNA from lambdoid bacteriophages and other viruses by agarose-gel electrophoresis. J. Virol. 14, 1235-1244 (1974).
- Smith, S. B., Aldridge, P. K., Callis, J. B. Observation of individual DNA molecules undergoing gel electrophoresis. Science. 243, 203-206 (1989).
- Aaji, C., Borst, P. The gel electrophoresis of DNA. Biochim. Biophys. Acta. 269, 192-200 (1972).
- Lai, E., Birren, B. W., Clark, S. M., Simon, M. I., Hood, L. Pulsed field gel electrophoresis. Biotechniques. 7, 34-42 (1989).
- Devor, E. J. . IDT tutorial: gel electrophoresis. , (2010).
- Serwer, P. Agarose gels: properties and use for electrophoresis. Electrophoresis. 4, 375-382 (1983).
- Dea, I. C. M., McKinnon, A. A., Rees, D. A. Tertiary and quaternary structure and aqueous polysaccharide systems which model cell wall adhesion: reversible changes in conformation and association if agarose, carrageenan and galactomannans. J. Mol. Biol. 68, 153-172 (1972).
- Sharp, P. A., Sugden, B., Sambrook, J. Detection of two restriction endonuclease activities in H. parainfluenzae using analytical agarose-ethidium bromide electrophoresis. 生化学. 12, 3055-3063 (1973).
