We beschrijven het gebruik van perfluorodecalin als een infiltratieve montage medium. Dit is een eenvoudige methode voor het verbeteren van de diepte van beeldvorming in<em> Arabidopsis thaliana</em> Bladweefsel met een minimale fysiologische impact.
Het probleem van het verwerven van een hoge-resolutie beelden diep in biologische monsters wordt algemeen erkend 1. In lucht gevulde weefsel, zoals de sponsachtige bladmoes van de bladeren van de planten of ongewervelde longen verdere problemen vloeien voort uit verschillende overgangen in brekingsindex tussen de cellulaire componenten, tussen de cellen en luchtruim en tussen de biologisch weefsel en de rest van het optische systeem. Bovendien brekingsindex mismatches leiden tot een verzwakking van de fluorofoor excitatie en signaal emissie in fluorescentie microscopie. We beschrijven hier de toepassing van de perfluorkoolstof, perfluorodecalin (PFD), als een infiltratieve imaging medium die optisch beter laser scanning confocale microscopie (LSCM) monster beeldvorming op diepte, zonder toevlucht te nemen tot beschadiging van stijgingen van de laser kracht en heeft een minimale fysiologische invloed 2. We beschrijven het protocol voor het gebruik van PFD met Arabidopsis thaliana bladweefsel, dat is optisch complex als een gevolg van destructuur (figuur 1). PFD heeft een aantal eigenschappen die het geschikt is voor dit gebruik 3. De brekingsindex van PFD (1.313) is vergelijkbaar met die van water (1.333) en is dichter bij die van cytosol (ca. 1,4) dan de lucht (1.000). Daarnaast, PFD is direct beschikbaar, niet-fluorescerende en is niet giftig. De lage oppervlaktespanning van PFD (19 dynes cm -1) is lager dan die van water (72 dynes cm -1) en ook onder de limiet (25 tot 30 dyne cm -1) voor stomatale penetratie 4, die het mogelijk maakt om overstroming de sponsachtige bladmoes luchtruim zonder toepassing van een potentieel destructieve vacuüm of oppervlakte-actieve stof. Ten slotte, en van cruciaal belang, PFD heeft een grote capaciteit voor het oplossen van CO 2 en O 2, waardoor gasuitwisseling te worden gehandhaafd in het overstroomde weefsel, dus het minimaliseren van de fysiologische impact op het monster. Deze eigenschappen zijn gebruikt in diverse toepassingen waarbij een gedeeltelijke vloeibare ademhaling en longen inflatie onderTIE 5,6, chirurgie 7, 8 kunstmatig bloed, zuurstof van de groeimedia 9, en studies van ijs kristalvorming in planten 10. Op dit moment is het gebruikelijk om weefsel te monteren in water of waterige buffer voor live confocale imaging. Wij zijn van mening dat het gebruik van PFD als een bevestiging medium een verbetering op de bestaande praktijk vertegenwoordigt en laat de eenvoudige bereiding van levende hele blad monsters voor de beeldvorming.
Dit is een eenvoudige en makkelijk te gebruiken techniek om microscopie van met lucht gevulde of optisch complexe weefsels te verbeteren. We hebben aangetoond dat de techniek een aantal sterke voordelen heeft en we hopen dat het gebruikt zal worden om biologische vragen met betrekking tot lucht-rijke weefsels toe te lichten. Bijvoorbeeld: het zou een logische keuze voor de studie van pathogene aanval in plant bladmoes of in de longen zijn. We zijn ook bewust van de beperkingen van de techniek. We werken aan een betere brekingsindex matching, gebruik met andere vormen van microscopie, en perfluorkoolstof inbedmiddel replenishment tijdens lange tijdschaal experimenten. We hebben ook wel erkennen dat een van de belangrijkste voordelen van PFK's, namelijk als biologisch inert een keerzijde heeft. PFK's niet gemakkelijk oplossen biologische moleculen, die ook betekent dat ze niet gemakkelijk kan worden gebruikt om de verbindingen van belang, zoals hormonen, drugs, en andere kleine moleculen of ionen te leveren.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs willen graag aan prof. Nicholas Smirnoff van de Universiteit van Exeter bedanken voor zijn advies en de Universiteit van Exeter BioImaging faciliteit. De financiering werd verstrekt door de Britse biotechnologie en Biologische Wetenschappen Research Council (subsidie referentie BB/E002682/1).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | コメント |
Perfluorodecalin | F2 Chemicals | N/A | Telephone to order. |
Carolina Observation Gel | Blades Biological | 13-2700 |