Мы демонстрируем<em> В естественных условиях</em> Электропорации протокол для трансфекции одного или небольших групп ганглиозных клеток сетчатки (РГК) и другие типы клеток сетчатки в постнатальном мышей в широком диапазоне возрастов. Возможность маркировать и генетически манипулировать послеродовой РГК<em> В естественных условиях</em> Является мощным инструментом для развития исследований.
Адресности и уточнение РГК проекции среднего мозга является популярным и мощным модельной системы для изучения того, как точной модели нейронной форма связи в процессе разработки. У мышей, retinofugal прогнозы расположены в топографических порядке и по форме глаз конкретных слоев наружного коленчатого тела (dLGN) таламуса и верхний бугорок (SC). Развитие этих точных моделей retinofugal прогнозы как правило, были изучены маркировки популяций РГК с флуоресцентными красителями и индикаторов, таких, как пероксидаза хрена 1-4. Однако, эти методы слишком грубы, чтобы дать представление о развитии изменений в отдельные РГК аксонального морфологии беседки, которые являются основой retinotopic формирование карты. Они также не позволяют генетические манипуляции РГК.
В последнее время электропорации стала эффективным методом для обеспечения точной пространственной и временной контроль на поставку заряженных молекул в сетчатку 5-11. Текущий сетчатки протоколов электропорации не позволяют генетических манипуляций и отслеживание retinofugal проекции одного или небольшой кластер РГК в постнатальном мышей. Утверждалось, что в послеродовом электропорации естественных условиях не является жизнеспособным методом трансфекции РГК с маркировки эффективность крайне мала и, следовательно, требует ориентации на эмбриональном возрасте, когда RGC прародителей проходят дифференциации и пролиферации 6.
В этом видео мы описываем в естественных условиях электропорации протокол для адресной доставки генов, shRNA и флуоресцентные декстраны с мышиным РГК постнатально. Эта техника представляет собой экономически эффективный, быстрый и относительно легко платформу для эффективного скрининга генов-кандидатов, участвующих в нескольких аспектах развития нервной системы, включая аксон опровержение, ветвящийся, ламинирование, регенерацию и формирование синапса на различных этапах схемы развития. В заключение мы описываем здесь ценным инструментом, который обеспечит более полное представление о молекулярных механизмах основной сенсорное развитие карте.
В этом видео мы демонстрируем в протокол электропорации естественных условиях, что приводит к маркировке одного или небольших групп нейронов сетчатки в постнатальном мышей с ДНК-конструкции кодирования флуоресцентных белков. Малые кластеры флуоресцентно меченных РГК прое?…
The authors have nothing to disclose.
PCAG-gapEGFP плазмиду подарок от д-р С. Макконнелл (Стэнфорд, Калифорния). pCAG-tdTomato плазмиду подарок от д-ра М. Феллер (Беркли, Калифорния). Мы благодарим д-р Эдвард Ruthazer за предложение использование двух плазмид стратегии для одной маркировки клеток и Энн Schohl (Montreal, QC) для проверки двух плазмид Cre / loxP стратегии в экспериментальных исследованиях и членов Crair лабораторию для технической поддержки. Поддержка R01 MH62639 (MC), NIH R01 EY015788 (MC) и NIH P30 EY000785 (МК).
Materials | Company | Catalog number |
---|---|---|
Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 |
Electrical Stimulator | Grass Instruments | Model S4 |
Oscilloscope | Agilent | Model 54621A |
Audio monitor | Grass Instruments | Model AM8B |
Puller | Sutter Instruments | Model P-97 |
Vannas Scissors a | World Precision Instruments | 14003 |
Micro Scissors b | Ted Pella | 1347 |
Dumont AA Forceps c | Fine Science Tools | 11210-20 |
Nanoinject II System | Drummond Scientific | 3-000-204 |
Glass Pipettes | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X |
Foot pedal | Drummond Scientific | 3-000-026 |
Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M3516 |
DiI | Invitrogen | D-383 |
N,N-Dimethylformamide | Sigma | D4551 |