Nous démontrons une<em> In vivo</emProtocole d'électroporation> pour la transfection des grappes simples ou petites des cellules ganglionnaires de la rétine (CGR) et d'autres types de cellules rétiniennes chez les souris postnatale sur un large éventail d'âges. La capacité d'étiqueter et de manipuler génétiquement CGR postnatale<em> In vivo</em> Est un outil puissant pour les études de développement.
Le ciblage et le raffinement des projections de la CJR mésencéphale est un système modèle populaire et puissant pour étudier comment les schémas précis de la forme de connectivité neuronale pendant le développement. Chez les souris, les projections sont retinofugal disposés de manière topographique et la forme des yeux spécifique des couches dans le corps genouillé latéral (dLGN) du thalamus et le colliculus supérieur (CS). Le développement de ces modèles précis de prévisions retinofugal a généralement été étudié par marquage des populations de CGR avec des colorants fluorescents et les traceurs, comme la peroxydase de raifort 1-4. Cependant, ces méthodes sont trop grossiers pour donner un aperçu des changements développementaux dans les différents morphologie tonnelle CJR axonale qui sont la base de la formation Plan rétinotopiques. Ils ne permettent pas de la manipulation génétique des CGR.
Récemment, l'électroporation est devenue une méthode efficace pour fournir un contrôle précis spatiale et temporelle pour la livraison de molécules chargées dans la rétine 5-11. Les protocoles actuels électroporation rétine ne permettent pas de manipulation génétique et le traçage des projections retinofugal d'un cluster unique ou petite des CGR chez la souris postnatale. Il a été soutenu que postnatale chez électroporation in vivo n'est pas une méthode viable pour la transfection CGR car l'efficacité de l'étiquetage est extrêmement faible et donc nécessite de cibler à l'âge embryonnaire, lorsque les progéniteurs CJR sont en cours de différenciation et la prolifération 6.
Dans cette vidéo, nous décrivons une électroporation in vivo dans le protocole d'administration ciblée de gènes, shRNA, et dextranes fluorescents au CGR murin après la naissance. Cette technique fournit une solution rentable, rapide et relativement facile pour la plate-forme de dépistage efficace de gènes candidats impliqués dans plusieurs aspects du développement neural, y compris la rétraction des axones, ramification, le laminage, la régénération et la formation des synapses à différents stades de développement des circuits. En résumé, nous décrivons ici un outil précieux qui permettra de mieux appréhender les mécanismes moléculaires qui sous-tendent le développement carte sensorielle.
Dans cette vidéo, nous démontrons une électroporation in vivo dans le protocole que les résultats en matière d'étiquetage des grappes simples ou peu de neurones rétiniens chez les souris postnatale avec des constructions d'ADN codant pour des protéines fluorescentes. De petits groupes de marquage fluorescent des projections de la CJR dLGN et SC reproduit les modèles de projection similaires que les études précédentes utilisant l'étiquetage RGC avec les colorants lipophiles, ce qui indiq…
The authors have nothing to disclose.
Le plasmide pCAG-gapEGFP était un don du Dr. S. McConnell (Stanford, CA). pCAG-tdTomato plasmide a été un cadeau du Dr M. Feller (Berkeley, Californie). Nous remercions le Dr Edward Ruthazer pour suggérer l'utilisation d'une stratégie à deux plasmides pour l'étiquetage seule cellule et Anne Schohl (Montréal, QC) pour la validation des deux plasmides Cre / loxP stratégie dans des études pilotes et membres du laboratoire Crair pour le soutien technique. Soutenu par R01 MH62639 (MC), le NIH R01 EY015788 (MC) et NIH P30 EY000785 (MC).
Materials | Company | Catalog number |
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Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 |
Electrical Stimulator | Grass Instruments | Model S4 |
Oscilloscope | Agilent | Model 54621A |
Audio monitor | Grass Instruments | Model AM8B |
Puller | Sutter Instruments | Model P-97 |
Vannas Scissors a | World Precision Instruments | 14003 |
Micro Scissors b | Ted Pella | 1347 |
Dumont AA Forceps c | Fine Science Tools | 11210-20 |
Nanoinject II System | Drummond Scientific | 3-000-204 |
Glass Pipettes | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X |
Foot pedal | Drummond Scientific | 3-000-026 |
Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M3516 |
DiI | Invitrogen | D-383 |
N,N-Dimethylformamide | Sigma | D4551 |