O Sistema de Fibra gigante é um circuito neuronal simples de adulto<em> Drosophila melanogaster</em> Contendo os maiores neurônios na mosca. Nós descrevemos o protocolo para monitoramento da transmissão sináptica por essa via, registrando os potenciais pós-sinápticos na longitudinal dorsal (DLM) e (TTM) tergotrochanteral músculos após a estimulação direta dos interneurônios Fiber Giant.
Quando assustou adulto D. melanogaster reagir pulando no ar e voar para longe. Em muitas espécies de invertebrados, incluindo D. melanogaster, a resposta do "escape" (ou "assustar") durante o estágio adulto é mediada pelo circuito multi-componente neuronal chamado Sistema Fibra Giant (GFS). O tamanho grande comparativa dos neurônios, sua morfologia distintiva e conectividade simples fazer o GFS um sistema modelo atraente para o estudo de circuitos neuronais. A via GFS é composta de dois gigantes bilateralmente simétricos de fibra (GF) interneurônios cujos axônios descem do cérebro ao longo da linha média para o gânglio torácico por meio do conectivo cervical. No neuromere mesothoracic (T2) dos gânglios ventral a forma FG electro-química sinapses com 1) os grandes dendrite medial do motorneuron ipsilateral (TTMn) que aciona o músculo tergotrochanteral (TTM), o principal extensor para o fêmur mesothoracic / perna e 2) a sinapse perifericamente interneurônio contralateral (PSI), que por sua vez em formas químicas (colinérgicos) sinapses com o motorneurons (DLMns) dos músculos dorsal longitudinal (DLMS), os depressores asa. A via neuronal (s) para os músculos dorsovental (DVMs), os elevadores asa, ainda não foi elaborada (o DLMS e DVMs são conhecidas conjuntamente como os músculos de vôo indiretos – não estão ligados diretamente para as asas, mas sim mover o asas indiretamente por cutícula distorcer a próxima torácica) (King e Wyman, 1980;. Allen et al, 2006). A ativação di-sináptica da DLMS (via PSI) causa um atraso pequeno, mas importante no momento da contração desses músculos em relação à ativação monossináptico de TTM (~ 0,5 ms) permitindo que o TTMs primeiro estender o fêmur e impulsionar o voar fora da terra. O TTMs simultaneamente esticar-ativar o DLMS que por sua vez mutuamente estiramento ativar o DVMs para a duração do voo. O caminho GF pode ser ativado ou indiretamente pela aplicação de um estímulo sensorial ("sopro de ar" ou "luzes", por exemplo), ou diretamente por um estímulo supra-limiar elétrico para o cérebro (descrito aqui). Em ambos os casos, um potencial de ação alcança o TTMs e DLMS unicamente através da FG, PSIs e TTM / DLM motoneurônios, embora o TTMns DLMns e têm outras, ainda não identificado, entradas sensoriais. Medição "resposta de latência" (o tempo entre o estímulo e despolarização do músculo) e "a seguir para a estimulação de alta freqüência" (o número de respostas de sucesso para um certo número de estímulos de alta freqüência) fornece uma maneira de reproduzível e quantitativamente avaliar o estado funcional dos componentes GFS, incluindo tanto as sinapses central (GF-TTMn, GF-PSI, PSI-DLMn) e química (glutamatérgico) junções neuromusculares (TTMn-TTM e DLMn-DLM). Ela tem sido usada para identificar genes envolvidos na formação de sinapses centrais e para avaliar a função do SNC.
Uma das coisas mais importantes que é preciso prestar atenção quando tentando obter gravações de alta qualidade é a orientação correta e de saúde da preparação. Idealmente, a mosca ainda deve estar vivo no final da sessão de gravação e responsivo aos estímulos elétricos. Para os eletrodos de gravação para penetrar de forma mais eficiente o exoesqueleto torácica, a mosca deve ser colado à superfície de modo a formar um ângulo reto com os eletrodos, se necessário, a inserção dos eletrodos pode ser facilitado através da remoção de uma parte da cutícula torácica dorsal com um bisturi de tungstênio expondo assim o músculo de vôo DLM (este passo oferece uma vantagem adicional de tornar mais difícil para as pontas dos eletrodos de vidro para quebrar). Além disso, o cuidado deve ser tomado para evitar empurrar os eletrodos através do DLMS subcuticularly localizado e TTMs. A cabeça da mosca devem ser bem protegidos para permitir a eletrodos estimulantes para ser devidamente inserido no cérebro e para impedi-los de que está sendo retirado durante a sessão de gravação.
Devido ao seu tamanho e bem descrita a morfologia, o GFS representa uma das vias mais acessíveis neuronal em Drosophila. A permeabilidade das sinapses elétricas a pequenas corantes marcador molecular de peso permite a visualização de neurônios eletricamente acopladas, e várias linhas disponíveis GAL4 torná-lo possível manipular os níveis de expressão de genes em um subconjunto de células ou grupos de células (Jacobs et al, 2000;. Allen et al., 2006) Além das vantagens acima mencionadas, ambos os componentes aferentes e torácica das propriedades do circuito de exibição, como recuperação de habituação, espontânea e dishabituation, tornando o GFS Drosophila um sistema modelo conveniente para o estudo da plasticidade neuronal (Engel e Wu, , 1996).
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado pelo Wellcome Trust uma subvenção para LP
NAME | COMPANY | CAT. # | COMMENTS |
S48 Square Pulse Stimulator | Grass Instruments | http://www.grasstechnologies.com/ | |
Stimulation unit | Grass Instruments | http://www.grasstechnologies.com/ | |
SIU5 RF Transformer Isolation Unit | Grass Instruments | http://www.grasstechnologies.com/ | |
5A two-channel intracellular Microelectrode Amplifier | Getting Instruments | http://www.gettinginstruments.com/ | |
Digidata 1440A data acquisition system | Molecular Devices | http://www.moleculardevices.com/ | |
Analogue-digital Digidata 1320 and Axoscope 9.0 software | Molecular Devices | http://www.moleculardevices.com/ | |
Recording platform with manual micromanipulators | Narishige, Sutter Ins., World Precision Ins. | http://narishige-group.com/ http://www.sutter.com/index.html http://www.wpi-europe.com/en/ |
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Light source | Fostec | http://www.nuhsbaum.com/FOSTEC.htm | |
Wild M5 stereomicroscope | Wild Heerbrugg | http://www.wild-heerbrugg.com/ | |
Vibration isolation table | TMC | http://www.techmfg.com/ | |
Borosilicate tubing for microelectrodes | Sutter Instrument | http://www.sutter.com/index.html | |
P-95 Micropipette puller | Sutter Instrument | http://www.sutter.com/index.html | |
Microfil 34 gauge, 67 mm (electrode filler) | World Precision Instruments | MF34G-5 | http://www.wpi-europe.com/en/ |
Microdissection tools (forceps,…) | Fine Science Tools | www.finescience.com | |
Dissecting (stereo) microscope | Leica | http://www.leica-microsystems.com/ | |
Faraday cage | Unknown manufacturer |
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