1. 체계적 전달 방법 약물의 전신 배달 CNS 높은 약물 농도를 달성하기위한 가장 효율적인 방법은 아니지만, 체계 배달이 편리하고 잘 환자로 받아들였습니다. 정맥 주사, intraperitoneal 주사 및 경구 gavage : 여기, 우리는 세 일상적으로 사용하는 조직 관리 방식에 대한 적절한 절차를 보여줄 것입니다. A. 정맥 주입 (타일 베인 사출) 절차를 시작하기 전에, 각 마우스의 체중이 기록되어야합니다. 모든 잠복기 연구와 마찬가지로, 체중은 잠재적 약물 독성을 평가하기 위해 (일주일에 두 번 이상) 정기적으로 모니터링해야합니다. 볼륨에서 마우스의 체중의 2 개 이상의 %는 한 번에 주입해야합니다. 예를 들어, 더 이상 유체의 0.2mL 이상은 20g 마우스에 주입해서는 안됩니다. 정맥 주입 모든 유체는 적절한 방법으로 소독하여야한다. 마우스는 가열 패드 또는 꼬리 정맥을 팽창하기 위해 가열 램프을 사용 5~10분위한 워밍업해야합니다. 가열 램프를 사용하는 경우 고열을 피하기 위해 항상 마우스를 모니터합니다. 마우스는 꼬리 정맥 (동영상 참조)에 대한 액세스를 허용하는 동안 마우스를 멈출 들고 장치로 전송됩니다. 마우스 꼬리 네 개의 보이는 선박이 있습니다 지느러미와 측면 양쪽에있는 혈관은 정맥, 그리고 복부 측면에있는 혈관은 동맥이다. 꼬리 정맥에 액세스하려면 마우스의 꼬리가 가장 말초 지점에서 개최하고, 정맥은 위쪽에 직면하고 있다고 90도 너무 회전합니다. 사출 사이트는 알코올 면봉과 함께 청소하고 28g 인슐린 주사기는 (동영상 참조) 정맥에, beveled 측면을 삽입됩니다. 바늘이 제대로 정맥에 배치하는 경우, 그것은 자유롭고 부담없이 이동해야합니다. 천천히 5-10초여도 압력과 마약을 주입. 물집이 꼬리에 나타나면 이것은 바늘이 혈관에 더 이상 없다는 것을 나타냅니다로, 주입을 중지합니다. 출혈이 멈출 때까지 주사 후 주사 사이트에 부드러운 압력을 적용합니다. 이것은 일반적으로 30~60초 걸립니다. 더 이상의 출혈이 없다는 것을 막기 위해 사출 후 50-10분 마우스를 모니터합니다. B. Intraperitoneal 사출 주입을 시작하기 전에 약물은 28g 바늘에 연결된 주사기에로드해야합니다. 공간 (예, 200μL를 주입하면 주사기 용량 300μL 이상 있는지 확인) 사출하기 전에 플런저를 다시 그리기 위해 주사기 안에 있는지 확인합니다. 마우스 손잡이에 뭔가가있다 있도록 꼬리로 새장에서 마우스를 제거하고 거친 표면에 그것을 놓으십시오. 케이지 뚜껑은 대개 충분합니다. 마우스는 몸을 스트레칭하고 다음 비 지배적인 손을 사용하는 허용 가볍게 당신의 엄지와 검지와 가운데 손가락 (동영상 참조) 사이에 최대한 피부를 꼬집어보고를 돌보는 마우스의 뒷면에있는 피부를 파악. 그래서 마우스의 복부가 위쪽에 직면하고 있다고 위로 마우스를 켭니다. 마우스가 자유롭게 머리를 이동할 수있다면, 사출 동안 물리지 않도록을 줄 수있는만큼, 손잡이를 해제하고 다시 시도하십시오. 당신의 지배적인 손으로 주사기를 선택하고 마우스의 왼쪽 하단 사분면 (동영상 참조)에 30도 각도로 바늘을 삽입합니다. 약간 거꾸로 마우스를 개최하는 것은 멀리 주사 사이트에서 장기를 이동하는 데 도움이됩니다. 바늘이 intraperitoneal 공간에 있는지 확인하려면 주사기의 플런저에 다시 가져옵니다. 어떤 액체 또는 혈액이 주사기에 나타나는 경우, 바늘은 intraperitoneal 공간이 아니므로 삭제되어야합니다. 어떤 유체가 주사기에 aspirated 없다면, 1~5초 이상도 압력과 주사기의 내용을 삽입하고 마우스를 놓습니다. 마우스가 정상적인 활동 수준을 반환하기 위해 사출 후 5~10분 마우스를 모니터합니다. C. 구두 Gavage 주사를 시작하기 전에 마우스의 무게를 기록합니다. 경구 gavage에 의해 제공 수있는 최대 볼륨은 체중 kg 당 10mL입니다. 예를 들어, 20g 마우스의 최대 볼륨은 200μL 것입니다. 큰 볼륨을 삽입하려고 시도하는 것은 역류가 발생할 수 있습니다, 이것은 불완전 약물 전달의 원인이됩니다. 그것이 위에 명시된 것보다 더 큰 볼륨을 관리하는 데 필요한 경우, 많은 셋처럼 복용 24 시간 이상 실시 수 있습니다. 식도를 펑쳐링 방지하기 위해서는 각각의 마우스에 대한 gavage 바늘의 길이를 측정하는 것이 중요합니다. 마우스의 마지막 늑골에 gavage 바늘을 곡선 18g 볼 팁을 보유하고 영구 마커 (동영상 참조)를 사용하여 마우스의 머리의 끝에 길이를 표시합니다. gavage 동안,이 마크는 마우스의 입안에 바늘을 삽입으로 막는 포인트가 될 것입니다. intraperitoneal 주사 같은 손으로 손잡이를 사용하여 마우스를 구속. 혀여, 입안에 gavage 바늘을 삽입하고 adva인두를 통해 바늘을 제정신. 중지 마르크 과거 바늘을 삽입하지 마십시오. 바늘은 어떤 압력 (비디오 참조)없이 원활하게 진행해야합니다. 당신이 압력을 발생하면 중지하고 폐 속에 유체를 주입하지 않도록하기 위해 바늘을 철회. 장소에 바늘로, 1~5초 통해 플런저를 우울하게하고 그것이 삽입된 것을 동일한 각도로 바늘을 제거합니다. 그 액체가 폐에를 입력했습니다 나타낼 수 있습니다 고심한 흔적이있는 호흡의 흔적에 가까운주의를 기울이고, 50-10분 마우스를 모니터합니다. 2. 로컬 배달 급성 대류 – 향상된 배달 A. 프로브 건설 설치류를위한 역류 방지 CED 정맥은 아직 상업적으로 사용할 수 없습니다. 여기 처음 Krauze 외 (Krauze 2005)에 의해 설명된 방법으로 적응했다 정맥 건설하는 방법을 설명합니다. 100uM 직경 실리카 튜브이를 통해 infusate 흐름, 구조 지원을위한 단단한 금속 바늘과 infusate 로딩을위한 유연한 테플론 튜브 :. 정맥은 세 부분 (그림 1)을 가지고 단단한 금속 바늘을 얻으려면, Surflo IV 카테터 (24g 탐침)에 플라스틱을 녹일와 족집게는 금속 바늘을 제거 사용하는 열린 불꽃을 사용합니다. 카테 테르의 나머지는 폐기 수 있습니다. 단일 에지 면도날을 사용하여 금속 바늘보다 약간 긴 실리카 튜브의 길이 (OD 0.163mm)를, 잘라. 튜브의 끝에 어떤 접착제를 못 돌보는 cyanoacrylate을 기반으로 빠른 속도로 연기 접착제 (예 : Krazy 풀로)의 작은 드롭 역할 실리카 튜빙. 금속 바늘의 실리카 튜브를 삽입하고 5 분 말리면. 일단 건조 실리카 튜빙은 단단히 바늘에 부착된해야합니다. 이산화 규소의 끝을이 줄어들 수 있도록해야한다는 바늘과 평면 끝 (비디오 참조)로부터 실리카 튜빙의 protrudes의 3mm의 지적 끝에서 실리카 튜빙의 protrudes의 2mm. 길이 테플론 튜브 20cm의 부분을 잘라 버릴거야. 다시 이것은 정맥을 방해할 수 있으므로 실리카 튜브의 끝에 접착제를하지 돌보는, 접착제의 작은 방울의 금속 바늘을 롤. 1cm의 깊이에 테플론 튜브에 바늘을 삽입합니다. 1 분 건조하자. 아교 총 사용하여 금속 바늘과 테플론 튜브 (동영상 참조) 사이의 공동에 뜨거운 접착제 한 방울을 적용합니다. 전체 관절이 사방에 덮여 있는지 확인하고 최소 1 시간 동안 건조하자. Cannulas 미리 주일까지 만들어 실온에서 저장할 수 있습니다. B. 주입 절차 외과 영역을 준비하려면, 모든 표면과 같은 2 % chlorhexidine 솔루션으로 살균제와 뿌렸해야합니다. 무균 수술 장갑이 절차를 수행하는 동안 착용해야합니다. 표면은 다음 흡수 커튼 덮여있다. 다음과 같은 소모품은 외과 영역에 배치되어야합니다 마우스 체온을 유지하기 위해 가열 패드 2 % chlorhexidine을 포함한 3 % 과산화수소를 포함하는 하나 하나, 2 작은 배양 접시 무균 거즈 및 면화 면봉 멸균 일회용 scalpels (번호 21) 무균 바늘 22g 마우스 stereotaxic 프레임 제어 속도 주사기 펌프 Autoclaved 마우스 피부 스테플러, 스테이 플스, 그리고 주요 제거 CED 정맥을 설정하려면, 플라스틱 주사기 어댑터 세트를 사용하여 테플론 튜브에 1mL 주사기를 첨부합니다. 그것이 (비디오 참조) 수술 표면에 직각이되도록 정맥은 stereotaxic 프레임에 부착된해야합니다. 정맥을 소독하기 위해, 70 % 에탄올로 1mL 주사기를 입력하고 정맥을 통해 에탄올을 실행하는 플런저를 우울. 멸균 생리를 사용하여이 과정을 반복하고, 정맥의 관절 주변에 누출이 있는지 확인합니다. 정맥의 외부를 소독하기 위해 부드럽게 70 % 에탄올로 닦아 닦아. 무균 식염수에 정맥을 작성하고 작은 기포가 정맥에 그려진되도록 주사기에 다시 가져옵니다. 공기 방울이의 정맥에있는 호수에서 infusate을 분리합니다. 그런 다음, backload하여 infusate (동영상 참조). 간단히 정맥을 실행하여 주사기 펌프 및 주요 펌프에 주사기를 연결합니다. 주입 마취 및 멸균 거즈 조각으로 여러 번 (5-10 초 동안) 보라고하여 피부를 준비를 사용하여 진정 마우스는 2 % chlorhexidine 솔루션에 담근. 안과 연고는 절차를 수행하는 동안 충분한 수분을 유지하기 위해 마우스에 적용해야합니다. 멸균 메스를 사용하여 (동영상 참조) 길이 약 1.5cm, 두개골의 중심을 따라 화살 절개를 만듭니다. 두개골 표면은 다음 3 % 과산화수소 용액에 담가 면봉을 사용하여 청소합니다. 마우스의 눈에 과산화수소를 받고 않도록 조심해. 두개골의 봉합 라인이 시점에서 분명해야합니다 그들이 표시되지 않은 경우, 부드럽게 동생과 함께 두개골을 면봉에쉬 커튼 면봉 3 %의 과산화수소 용액에 담가. 주입 사이트를 찾을 수 bregma (그림 2) 다음 오른쪽으로 2mm를 측정하고이 구조의 1mm의 후부를 식별합니다. 멸균 22g 바늘을 사용하여 부드럽게 두개골 (비디오 참조)에 대한 바늘을 복잡하게이 시점에서 두개골에 구멍을 만듭니다. 두개골에 대한 아래 바늘을 강요하지 마십시오. 이 시점에서 마우스가 stereotaxic 프레임에 배치하고 흡입 마취제를 (비디오 참조) 전송이 시작되어야합니다. 낮은 수준 (1 %)에서 마취를 관리하고, 신중하게 따라 마취 조정, 호흡 속도의 변화에 대한 마우스를 모니터합니다. 두개골 구멍을 통해 정맥 후 두개골 표면 아래 낮은 3mm를 놓습니다. 다음과 같은 요금 및 기간이을 사용하여 주입을 시작 : 0.1 μL / 5 분 분 0.2 μL / 5 분 분 0.5 μL / 5 분 분 0.8 μL / 7.5 분 분 OFF 1 분 주입의 끝에서 천천히 정맥 및 면봉 3 % 과산화수소로 두개골을 제거합니다. (동영상 참조) 구멍에 멸균 뼈 왁스를 적용합니다. 포셉을 사용하여 가까운 두개골과 주식을 통해 함께 피부를 그립니다. Buprenorphine의 게시가 수술 통증에 대한 관리해야합니다. 그것이 의식과 이동성을 차릴 때까지 사후 operatively 마우스를 모니터합니다. 때문에 프로 시저의 길이에, 그것은 모든 활동을 회복하기 위해 마우스를위한 시간까지 걸릴 수 있습니다. 이 시간 장소 동안 가열 패드에서 마우스 케이지는 저체온증을 방지하고, 다른 적극적인 생쥐와 복구 마우스를 집에서하지 않습니다. 스킨 스테이플은 수술 후 일주 제거되어야합니다. VIVO 이미징에서 C. 찬란 – 표시 infusate는 CED 관리 다음과 같은 몇 군데있을 수 있으며, 신호 강도의 변화뿐만 아니라 신호 위치를 모니터링할 수 있습니다. 일반적으로, 그것은 마우스를 주입에서 회복하도록 않도록, 이미지에 주입 후 2~3시간를 기다리는 것이 좋습니다. 이미징 동안 마취 들어, 흡입 마취의 낮은 수준을 사용합니다. 위치 마우스, 이미징 역에서 지느러미 측면 (예, IVIS 루미나, 칼리퍼 생명 과학, 알라 메다, CA). 몇 군데되는 플루어에 적절한 필터 설정을 사용하여 이미지를 획득. CED 들어, 성공적인 주입은 주입 사이트 (그림 3) 근처에있는 두뇌에있는 물질의 대부분을 표시합니다. 3. 대표 결과 치료의 행정 불리한 반응의 부족 성공적으로 분사의 중요한 지표이다. 예를 들어, 꼬리 정맥 주사 다음과 꼬리 모양의 변화 (예, 크기, 색상)가 없어야합니다. 꼬리 정맥 주입 다음 거품이나 물집은 피하 아닌 치료의 정맥, 납품을 나타내는 것입니다. intraperitoneal 주사 들어, 복부의 피부 변색의 충돌은 피하 주사 또는 내부 구조에 손상을 나타낼 수 있습니다. 경구 gavage에서와 마우스가 호흡이나 기침하는 것을 유체가 오히려 위장으로보다 폐에 주입되었다 나타낼 수 있습니다 보람. CED 들어, neurologic 기능은 치료의 성공적인 관리를 평가하기위한 중요합니다. 발작 또는 hemiparesis을 전시됩니다 마우스 부적 절한 주입을 받으셨을 것입니다. 형광 infusate를 사용하는 경우, 생체내 이미징 성공적으로 관리합니다 (그림 3) 평가에 대해 적용할 수 있습니다. infusate가 주사의 사이트 언어 있지 않다면, 주입은 성공적으로 완료되지 않은 것입니다. 그림 1 : CED 정맥 및 설정 외과. 대류 강화된 전달의 기본 요소는 수술이 설정 표시됩니다. microinfusion 펌프 (A)는 (B, 상단에있는 확대 그림 참조) 주입관에 첨부되어 있습니다. stereotaxic 프레임 (C)는 프로브를 위치로 사용됩니다. 이 이미지는 난방을 포함하지 않으며 마취 장비는 또한 절차를 수행하는 동안 사용됩니다. 그림 2 : 마우스 스컬 봉합해 라인. CED 주입 사이트 (레드 스타)은 화살과 코로나 봉합 (bregma)의 교차로를 식별하고 bregma의 2mm 수평 및 1mm는 사후 측정하여 찾을 수 있습니다. 그림 3 : 성공 CED의 대표 결과. 리멀리 붉은 형광 염료로 분류 posomes는 CED에 의한 마우스 뇌에 주입 및 생체내 및 전직의 생체내 두 군데 있었다. 성공적인 주입은 생체내 (A)와 예 생체내 (B) 두 주입의 사이트 언어 형광 신호를 보여줍니다. 신호는 contralateral 북반구에 누설하지 않고 주입 뇌를 현지해야합니다. 그림 4 : 랫 Brainstem에 성공 CED 대표 이미지. 찬란 – 표시 liposomes은 쥐의 brainstem에 주입했다. 쥐에서 많은 20μL로이 들어갈 수 있습니다. 쥐의 두개골과 생체내 이미징에서 배제 주입 깊이 있지만, 올바른 주입 위치의 증가 두께는 해부하는 뇌의 전 생체내 이미징에서 확인할 수 있습니다.