Este vídeo muestra cómo morfolino o ARNm puede ser inyectado en embriones de pez cebra en el estadio de una célula para aumentar o disminuir el nivel de productos específicos de genes durante el desarrollo posterior.
Una de las ventajas del pez cebra el estudio es la facilidad y la velocidad de la manipulación de los niveles de proteína en el embrión. Morfolinos, que son oligonucleótidos sintéticos con la complementariedad de los ARN antisentido objetivo, se puede agregar a los embriones para reducir la expresión de un producto genético particular. Por el contrario, el ARNm procesado se puede agregar a los embriones para aumentar los niveles de un producto genético. El vehículo para incorporar el uso de ARNm o morfolino a un embrión es la microinyección. Microinyección es eficiente y rápida, lo que permite la inyección de cientos de embriones por hora. Este video muestra todos los pasos necesarios para la microinyección. En pocas palabras, los huevos son recogidos inmediatamente después de ser despedido y se alinearon en contra de un portaobjetos de microscopio en una placa de Petri. A continuación, una aguja de punta fina cargados con material de inyección está conectado a un microinyector y una fuente de aire, y los controles microinyector se ajustan para producir un volumen de inyección deseable. Finalmente, la aguja se hundió en la yema del embrión y el morfolino o ARNm es expulsado.
Una de las fortalezas del sistema de modelo de pez cebra es la facilidad con que los productos de genes específicos puede ser añadido o eliminado del embrión mediante microinyección. Para doquier sobreexpresan una proteína en particular, el mRNA se inyecta en la yema de huevo en la etapa 1 de las células. Durante el desarrollo posterior del embrión, el ARN se distribuye por todo el organismo y traducido. Por el contrario, para eliminar una proteína en particular, morfolinos se utilizan. Morfolinos son oligonucleótidos sintéticos diseñados con la complementariedad de los ARN antisentido específicos. Al igual que los ARNm, morfolinos son inyectados en la yema de huevo en la etapa 1 de las células. Dentro del embrión, que se unen a sus ARNs dianas, la prevención de la traducción.
La principal modificación que debe hacerse para cada morfolino o ARNm es la concentración de material inyectado. Una concentración demasiado alta de cualquiera de morfolino o ARNm no puede causar la toxicidad específica, mientras que cada morfolino debe ser probado empíricamente para determinar su concentración óptima, generalmente entre las concentraciones de morfolino 200 M y M 500 derribar actividad de los genes con eficacia sin causar defectos no específicos. El tamaño exacto de la abertura de la aguja no es crucial. Dentro de un rango de tamaños de aguja, la presión de inyección y el tiempo de inyección se puede ajustar para producir un bolo del volumen correcto.
Morfolinos tienen muchas aplicaciones, incluyendo la disección funcional de los dominios de una proteína. Cuando estén diseñados para destinatarios específicos exón-intrón cruces, morfolinos evitará el empalme que se produzcan allí. Hemos examinado los efectos de dos morfolinos que se unen los exones e intrones cruces en el pre-ARNm de HEG. El heg_e3i3_egfr1 morfolino une la unión entre el exón 3 y el intrón 3, la prevención de la maquinaria de empalme de la incorporación de exón 3 en transcripciones de madurez. El heg_e4i4_egfr2 morfolino similar elimina el exón 4. Tanto los exones 3 y 4 de codificar los dominios que contienen EGF-como repite. Algunos embriones inyectados con heg_e4i4_egfr2 moderadamente fenocopia el mutante más experimentos serán necesarios para comprender el papel de HEG exón 4 en el desarrollo del corazón. Sorprendentemente, los embriones inyectados con heg_e3i3_egfr1 tiene edema cerebral, una característica que no se ve en los mutantes HEG. Esto puede ser debido a la capacidad de morfolinos para obligar a la madre que las transcripciones no se verían afectadas en los mutantes cigóticos.
Somos conscientes de los miembros del laboratorio de Mably y Storer Narie por su asistencia técnica, y la Asociación Americana del Corazón (NCRP Desarrollo Científico subvención 0635363N) y el National Heart, Lung, and Blood Institute (Grant SCCOR RFA HL02-027) para su financiación.
Material Name | タイプ | Company | Catalogue Number | Comment |
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Microinjector | Tool | Harvard Apparatus | PLI 100 | |
Micromanipulator | Tool | Narishige | MN 153 | |
Needle Puller | Tool | Sutter Instruments | P 97 | |
Glass Capillaries | Tool | World Precision Instruments | TW100 F6 | |
Microloader Pipettes | Tool | Eppendorf | 5242956.003 | |
Needle Holder | Tool | World Precision Instruments | MPH310 |