Gen Fonksiyon Analiz Zebra balığı Embriyolar Mikroenjeksiyon

Bölüm 1: Yumurta üretim ve toplama Enjeksiyon için önceki gece yerde bölücüler ile üreme tankları, balık kurdu. Istenirse toplam yumurta üretimi artırmak için balık, bir erkek iki kadın oranı ayarlanmış olabilir. Ertesi sabah, oda ışıkları sonra, açmak birkaç tankları bölücüler çekin ve bozulmamış çiftleşme süresi yaklaşık 20 dakika izin verir. Bir süzgeç kullanarak, üreme kafesleri yumurtaları toplamak ve yumurta su ile durulayın. Yumurta, yumurta su ile bir Petri kabı içine dökün ve bir transfer pipeti ile döllenmemiş yumurta ve enkaz kaldırmak. Balık, enjeksiyon için yumurta ilave tur üretmek için büyük tanklarda yeniden bir araya olabilir. Onlara tek bir hücre aşamasına geçmek izin vermeden üretilen yumurta maksimum numaraları için izin yumurta toplama zamanı ayarlayın. 100mm bir Petri kabı ters kapağı bir mikroskop lamı yerleştirin. Tek bir sütun oluşturan slayt kenarına yumurta hattına bir transfer pipet kullanın. Yumurta ters tarafına karşı Kimwipe basarak slayt fazla yumurta su çıkarın. (Şekil 1A) Bölüm 2: İğne yükleme, çekme, ve hazırlık Mikropipet çektirmesi ile aptalca macun rampalar üzerinden atarak, 150mm Petri kabındaki iki iğne ve mağaza içine kılcal bir 1.0mm OD cam çekin. İğneler önceden çekilmiş olabilir. Microloader pipet kullanarak enjeksiyon malzemesinin 3 mcL Backload iğne. Kalan az veya hiç kabarcık kalmayana dek bolus iğne ucu doğru sallayın. Hava kaynağı ve mikroenjektör açın. Mikroenjektör iğne takın ve konut içinde sıkı bir mühür sigorta. Mikromanipülatör geniş bir yelpazede hareket ve uyum sağlamak için uygun bir pozisyonda olup olmadığını kontrol edin. Mikroskop görüş sahneden yüksek düzlem, ve ucu ince bölgeye odaklanmak içine iğne ucu getirin. Iğne delmek koryon ve yumurta sarısı kadar dar ama hala tutarlı bir boncuk boyutu sunma yeteneğine sahip yaprakları bir noktada iğne çimdik, keskin forseps bir çift kullanın. Mikrometre üzerinde mineral yağ Bir damla her enjeksiyon hacmini hesaplamak için kullanılabilir. Yağ enjekte edildiğinde, enjeksiyon malzemesinin 500 0.1 mm çapında bir boncuk pL (Şekil 1B) içerir; 500 pL veya 1nL enjeksiyon birimleri genellikle kullanılır. Ayak pedalına basınız ve iğne kırparak ve gerektiği gibi enjeksiyon basıncı ayarlayarak boncuk büyüklüğündeki LCD ekran. İdeal enjeksiyon hacimleri, yumurta hacminin yaklaşık% 10 dolduracaktır. Iğne ucu kaliteli enjeksiyon kolaylığı ve sonuçların kalite ve tutarlılık çok önemlidir. Bölüm 3: Enjeksiyon Embriyoların dört hücreli aşamasında geçmiş gelişmiş değil. Olun İdeal olarak, embriyolar tek hücreli aşamada olmalıdır. Elinin tersiyle çanak tutan, iğne yumurta sütun doğru indirin. Pierce yüzey koryon ve yolk kesesi herhangi bir ezilme veya yırtılma izlerken tek bir düzgün bir vuruş sarısı girin. Yumurta sarısı (şekil 1C) içine enjeksiyon malzemesi enjekte edilir. Hava kabarcıkları enjekte ya da embriyo için ölümcül olabilir sarısı germe kaçının. Satır aşağı, bir pipet kullanarak tutarlı bir boncuk büyüklüğü ve sürdürmek için gerekli basınç ayarı, döllenmemiş bir görünüm veya enjeksiyon işlemi sırasında tahrip yumurta çıkarın. Yumurta bir sütun tamamladıktan sonra, temiz bir petri kabı içine enjekte edilen yumurta taşımak için yumuşak bir yumurta su akışı kullanın. Gerektiği kadar tekrarlayın. Bir kontrol gibi çeşitli uninjected embriyolar tutun. Gün birinin sonunda, ölü embriyolar kaldırmak ve enjekte edilen embriyoların sayısı kaydedin. Periyodik olarak enfeksiyon olasılığını azaltmak için çanak yumurta su değiştirin. Bölüm 4: Temsilcilik sonuç Enjekte ediliyor bağlı olarak, embriyolar kendi uninjected kardeşlerine göre daha düşük bir oranda hayatta kalabilirler. Neyse ki, bunlardan çok sayıda enjekte etmek kolaydır, bu nadiren bir sorun. Morphants biraz gecikmeli gelişim sergilemek için normaldir. Mikroenjeksiyon sonuçlarını göstermek için, biz, Cam protein Heart (HEG) düzeyleri işlemek için bu protokol kullanılır. HEG normal kalp gelişimi için gerekli bir transmembran proteindir. Onun yokluğunda, embriyolar dev girişi yolları ve odaları 1 kalpleri gelişir. Biz 500 mcM bir konsantrasyonda HEG heg_e3i3_egfr1 ve heg_e4i4_egfr2 karşı daha önce tanımlanmamış iki morpholinos enjekte etti. 2 gün yazılan gübreleme, uninjected kardeş kontrolleri (Şekil 2A ve B) beklenen normal görünür. Heg_e3i3_egfr1 ile enjekte Embriyolar beyin ödemi (Şekil 2C). Bu morphants en kalbini morfolojisi değişmiş olmasına rağmen, kendi odalarına normal büyüklükte (Şekil 2B). Embriyolar enjekteheg_e4i4_egfr2 sergi değişken kalp kusurları. Diğerleri büyük girişinin yolları ve orta derecede genişlemiş kulakçıklar (Şekil 2E ve F), bazıları normal görünür. Önceden 1 rapor HEG mutant, büyük ölçüde genişlemiş içeakımın ve atrium (Şekil 2G ve H). Ayrıca, tam uzunlukta cDNA HEG transkripsiyonu 400 ng / mcL mRNA wild tip embriyolar enjekte edildi . (Şekil 3A ve B) uninjected kontrolleri normalde geliştirirken, embriyolar ana gövde eksen, baş ve gövde nekrozu, ve orta hat defektleri (Şekil 3C kısaltılması, mRNA fenotiplerinin wild tip görünüm şiddetli Siklopi değişen bir spektrum sergi HEG ile enjekte ve D). Şekil 1 enjekte edilir. Embriyolar bir Petri kabındaki bir mikroskop lamı (A) karşı dizilmiştir. Enjeksiyon hacmi bir mikrometre yerleştirilen madeni yağ içine enjekte edilerek belirlenir. , Yaygın olarak kullanılan 500 pL, bir enjeksiyon hacmi 0,1 mm (B) bir çapa sahiptir. Hemen enjeksiyondan sonra, morfolino veya mRNA sarısı (C) noktasal bir nokta olarak görünür. Şekil 2 2 gün yazılan gübreleme, uninjected embriyoların brüt kusurları (A) veya kalp fenotip (B) vardır. Morfolino heg_e3i3_egfr1 enjekte Embriyolar beyin ödemi (C, ok) ama normal boyutlu kalp boşluklarının (D) var. Morfolino heg_e4i4_egfr2 enjekte Bazı embriyolar genişlemiş girişi yolları ve kulakçıklar (E, F) var. HEG mutantlar ölçüde genişlemiş girişi yolları ve kulakçıklar (G, H) var. (A), (C), (E) ve (G) 4x DIC görüntüler; (B), (D), (F) ve (H), 20x DIC görüntü. = atrium, = içeakımın. Şekil 3, 24 saat yazılan gübreleme, embriyolar (B) arasında bir nöral tüp hiçbir nekroz veya orta hat defektleri (A) ve açıkça tanımlanmış iki gözleri ile uzun, düz bir vücuda sahip uninjected. HEG mRNA enjekte Bazı embriyolar, aksine, kısaltılmış bir vücut ekseni, nekroz, misshaped Somitlerin (C) ve siklops (D) sergilerler. (A) ve (C) 4x DIC görüntüler; (B) ve (D) 20x DIC görüntülerdir.