Uso de oligonucleótidos sintéticos modificados para analizar enzimas metabolizadoras de ácidos nucleicos

Todas las formas de vida requieren enzimas de procesamiento de ácidos nucleicos para llevar a cabo procesos biológicos fundamentales, como la replicación, la transcripción y la reparación del ADN. Las funcionalidades enzimáticas clave para estas vías son las polimerasas, que generan copias de moléculas de ARN/ADN, las ligasas que se unen a sustratos de polinucleótidos, las nucleasas que los degradan, y las helicasas y topoisomerasas, que funden dúplex de ácidos nucleicos o cambian su topología 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Además, muchas de estas enzimas proporcionan herramientas moleculares esenciales para aplicaciones como la clonación, el diagnóstico y la secuenciación de alto rendimiento 11,12,13,14,15.

Las características funcionales, cinéticas y especificidades del sustrato de estas enzimas se pueden determinar utilizando sustratos de ADN/ARN marcados producidos por oligonucleótidos de recocido. El seguimiento de sustratos y productos se ha logrado tradicionalmente mediante la introducción de una etiqueta radiactiva (³²P) en el extremo de la hebra 5′, que luego puede ser detectada por película fotográfica o con un sistema de imagen de fósforo^16,17. Si bien los sustratos radiomarcados ofrecen el beneficio de una mayor sensibilidad experimental y no alteran las propiedades químicas de un nucleótido, los peligros potenciales para la salud de trabajar con radioisótopos han alentado el desarrollo de marcadores de ácidos nucleicos no radiactivos para proporcionar una alternativa más segura para la detección de ADN y ARN 18,19,20. Entre estos, la detección de fluorescencia, incluida la detección directa de fluorescencia, la fluorescencia resuelta en el tiempo y los ensayos de transferencia de energía/extinción de fluorescencia, se destacan como los más versátiles 21,22,23,24. La amplia gama de fluoróforos permite diferentes diseños de sustratos de ADN/ARN con reporteros únicos en cada oligonucleótido²⁵. Además, la estabilidad de los fluoróforos, en comparación con los radioisótopos, permite a los usuarios producir y preservar cantidades significativas de sustratos de ADN marcados con fluorescencia¹⁹. Estos sustratos marcados con fluoróforos se pueden incubar con la proteína de interés, junto con diferentes combinaciones de cofactores metálicos y nucleótidos, para analizar la actividad de unión y/o enzimática. La visualización de la unión o la actividad se puede observar utilizando varios canales de colorante de fluoróforo con un sistema de imágenes en gel. Dado que solo los oligonucleótidos marcados con fluorescencia serán visibles con esta técnica, cualquier aumento o disminución en el tamaño del oligonucleótido marcado será fácil de seguir. Los geles también se pueden teñir después, con tintes de tinción de ácidos nucleicos para visualizar todas las bandas de ADN presentes en el gel.

Las ligasas de ácidos polinucleicos son enzimas que unen fragmentos de ADN/ARN, catalizando el sellado de roturas mediante la formación de un enlace fosfodiéster entre los extremos 5′ del ADN fosforilado y el 3′ OH del ADN. Se pueden dividir en dos grupos según su requerimiento de sustrato de nucleótidos. Las ligasas dependientes de NAD altamente conservadas se encuentran en todas las bacterias²⁶, mientras que las enzimas dependientes de ATP estructuralmente diversas pueden identificarse en todos los dominios de la vida ^8,27. Las ligasas de ADN desempeñan un papel importante en el procesamiento de fragmentos de Okazaki durante la replicación, además de estar involucradas en varias vías de reparación del ADN, como la reparación por escisión de nucleótidos y bases, a través del sellado de muescas espontáneas y muescas que quedan después de la reparación ^8,10. Las diferentes ligasas de ADN exhiben capacidades variables para unirse a diferentes conformaciones de roturas de ADN, incluidas muescas en un dúplex, roturas de doble cadena, desajustes y brechas, así como híbridos de ARN y ADN 28,29,30. Se puede ensamblar una amplia gama de sustratos ligables mediante el recocido de oligonucleótidos con un fosfato 5′ para generar terminales 5′ y 3′ yuxtapuestos en un dúplex de ácido nucleico 31,32,33. El método de análisis más común es la resolución por urea PAGE en un formato de ensayo de punto final; Sin embargo, las innovaciones recientes han incluido el uso de la electroforesis en gel capilar, que permite un alto rendimiento³⁴, el perfil de espectrometría de masas³⁵, así como un ensayo de baliza molecular homogénea, que permite el monitoreo resuelto en el tiempo³⁶.

El primer paso en una reacción de ligadura es la adenilación de la enzima ligasa por trifosfato de adenosina (ATP) o dinucleótido de nicotinamida y adenina (NAD), lo que da como resultado un intermediario enzimático covalente. El segundo paso en la reacción es la adenilación del sustrato de ácido nucleico en el extremo 5′ del sitio de la muesca, que es seguida por la ligadura de las hebras de ácido nucleico. Muchas enzimas ligasas que se expresan recombinantemente en E. coli se purifican en forma adenilada y, por lo tanto, pueden ligar con éxito ácidos nucleicos sin la adición de un cofactor de nucleótidos. Esto hace que sea difícil determinar qué tipo particular de cofactor de nucleótidos requieren para la ligadura de ácidos nucleicos. Además de describir los ensayos para evaluar la actividad de la ADN ligasa, también se presenta un método para determinar de forma fiable el uso del cofactor mediante la desadenilación de la enzima utilizando sustratos no marcados.

Las nucleasas son un grupo grande y diverso de enzimas modificadoras de ADN/ARN y ARN catalítico que escinden los enlaces fosfodiéster entre los ácidos nucleicos³⁷. Las funcionalidades de la enzima nucleasa son necesarias en la replicación, reparación y procesamiento del ARN del ADN y se pueden clasificar por su especificidad de azúcar para el ADN, el ARN o ambos. Las endonucleasas hidrolizan los enlaces fosfodiéster dentro de una cadena de ADN/ARN, mientras que las exonucleasas hidrolizan las cadenas de ADN/ARN un nucleótido a la vez desde el extremo 3′ o 5′ y pueden hacerlo desde el extremo 3′ a 5′ o el extremo 5′ a 3′ del ADN³⁸.

Mientras que muchas proteínas nucleasas son inespecíficas y pueden estar involucradas en múltiples procesos, otras son altamente específicas para una secuencia particular o daño en el ADN ^6,39,40. Las nucleasas de secuencia específica se utilizan en una amplia gama de aplicaciones biotecnológicas, como la clonación, la mutagénesis y la edición del genoma. Las nucleasas populares para estas aplicaciones son las nucleasas^{de restricción 41}, las nucleasas de dedos de zinc⁴², las nucleasas efectoras de tipo activador transcripcional y, más recientemente, las nucleasas CRISPR⁴³ diseñadas guiadas por ARN. Recientemente se han identificado nucleasas específicas de daño, como la nucleasa EndoMS, que tiene especificidad para las discordancias en el ADN a través de su dominio^de nucleasa similar a RecB específico de discordancia ^5,44. Los ensayos de actividad nucleasa, históricamente, se han realizado como ensayos discontinuos con sustratos radiomarcados; Sin embargo, además de sus otros inconvenientes, estos no permiten la identificación del sitio que es cortado por una proteína nucleasa, lo que es posible cuando se utilizan sustratos marcados con fluorescencia ^45,46. Más recientemente, se han desarrollado ensayos continuos de nucleasas que funcionan mediante el uso de diferentes tintes de ADN que interactúan con el ADN en diferentes estados; por ejemplo, emitiendo una señal fluorescente más alta al interactuar con el ADNd que en su estado no unido, o uniéndose específicamente a ARN cortos⁴⁷. Otros ensayos de nucleasa continua utilizan horquillas de ADN con un grupo fluoróforo en el extremo 5′ y un extintor en el extremo 3′ para que la fluorescencia aumente a medida que el oligonucleótido se degrada debido a una separación del fluoróforo y el extintor. Si bien estos ensayos permiten caracterizar la cinética de las proteínas que degradan el ADN, requieren un conocimiento previo de la función y el sustrato de la enzima y también se limitan a las enzimas que cambian la conformación del ADN para causar una diferencia en la unión del colorante. Por esta razón, los ensayos de punto final que resuelven productos individuales de nucleasa siguen siendo deseables para proporcionar información sobre las modificaciones del ADN causadas por la actividad de las proteínas.

Aquí, se presenta un procedimiento detallado para el diseño de oligonucleótidos de ADN/ARN marcados con fluorescencia que se pueden mezclar y combinar para generar sustratos para probar la actividad de nuevas enzimas nucleasa, polimerasa y ligasa. La validación de este conjunto básico de secuencias de oligonucleótidos simplifica el diseño experimental y facilita el perfilado económico de una amplia gama de funcionalidades enzimáticas sin necesidad de comprar un gran número de sustratos a medida. Se proporciona un procedimiento detallado para ejecutar un ensayo estándar de enzimas de procesamiento de ADN con estos sustratos, utilizando el ejemplo de la actividad de la ADN ligasa y se describen las modificaciones para analizar las enzimas nucleasa y polimerasa. Además, se proporciona un ensayo modificado para determinar la especificidad del cofactor de la enzima ADN ligasa con alta precisión, y se utilizan sondas de doble marcado para evaluar el ensamblaje de ligaduras multicomponente. Finalmente, se discuten las modificaciones al formato básico del ensayo para permitir su uso para determinar las interacciones proteína-ADN con los mismos sustratos mediante el ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA).